红豆杉细胞系种质保存及遗传变异研究

论文摘要

红豆杉细胞系在继代培养过程存在不稳定现象,表现在随着继代次数的增加,细胞合成紫杉醇的能力逐渐下降,这严重制约着红豆杉细胞进行大规模培养生产紫醇的的工业化进程,对于其不稳定性机理已经有了一些研究,但尚不明确。因而建立一种稳定保存红豆杉种质的方法,可缓解红豆杉细胞常温继代过程中的变异。本研究对红豆杉细胞低温缓慢生长保存及其遗传变异,以及超低温保存进行了研究,获得如下结果：1)首先建立了系列抗前体筛选红豆杉细胞系。通过在培养基中添加苯丙氨酸,苯甲酸钠和乙酸钠,经半年时间筛选获得了产量提高了1.35倍的细胞系。2)对低温缓慢生长法保存红豆杉细胞进行了较为系统的研究,发现：(1)低温缓慢生长法保存前后,红豆杉细胞细胞表观形态和紫杉醇产量与对照相比没有显著差异,但在恢复培养2个周期后,细胞系发生了变异,表现在紫杉醇含量下降,且保存时间越长,含量下降越快。(2)利用反相高效液相检测技术(HPLC)对低温保存后恢复培养过程中红豆杉细胞基因组甲基化水平分析,发现低温保存后恢复培养的细胞系的DNA甲基化水平升高,表明细胞培养过程中紫杉醇含量的下降可能与某些基因的甲基化有关。3)研究了玻璃化法、预培养干燥法、干燥／玻璃化法三种方法对红豆杉细胞系进行超低温保存的可行性,初步建立了红豆杉细胞超低温保存体系。(1)对影响玻璃化超低温保存的因素进行了系统研究,发现预培养方式,冰冻保护剂种类,脱水时间对红豆杉细胞超低温保存的存活率有比较大的影响,但在最优条件下,保存后细胞恢复生长需45 d；(2)预培养干燥法成功用于中国红豆杉细胞的保存,干燥／玻璃化法成功实现了中国红豆杉和曼地亚红豆杉的保存,进一步研究发现其原因可能是曼地亚红豆杉比中国红豆杉临界含水量高,需要冰冻保护剂的保护才能在进入液氮时顺利越过冰点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪言
• 1.1 课题提出
• 1.2 红豆杉细胞大规模培养生产紫杉醇的研究进展
• 1.3 药用植物种质资源离体保存方法研究进展
• 1.4 药用植物种质资源离体种质保存中的遗传变异
• 1.5 本研究的主要内容及目的意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 仪器设备和试剂
• 2.3 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 红豆杉抗前体添加高产细胞系的选育
• 3.2 红豆杉细胞系的低温缓慢生长法保存及遗传变异
• 3.3 红豆杉细胞超低温保存方法研究
• 4 讨论
• 4.1 低温缓慢生长法保存红豆杉细胞的可行性分析
• 4.2 红豆杉细胞超低温保存的可行性分析
• 5 全文总结与展望
• 5.1 全文总结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献