蛋清蛋白水解物的制备、结构及其生物活性的研究

论文摘要

我国是世界上最大的蛋品生产国,而我国目前的禽蛋加工状况是蛋品加工水平低、技术陈旧,由于我国的某些饮食习惯和一些行业的特殊需求,蛋黄的需求量较大,在生产过程中,蛋清被当成废弃物丢弃,既造成了蛋清资源的极大浪费,又造成了环境的污染。酶法水解蛋清蛋白质制备活性肽能有效地利用我国丰富的蛋清资源,将产生巨大的经济和社会效益。另外对具有抗凝血酶生物活性的蛋清活性肽鲜见报道,因此开展蛋清蛋白活性肽的基础研究工作,具有一定理论意义。本论文以鸡蛋清为原料,以酶膜生物反应器制备具有抗凝血酶和抗氧化生物活性的蛋清蛋白水解物（EWPH）,主要研究内容如下:建立了一种体外测定抗凝血酶活性的方法。建立的新方法具有成本低、灵敏度高、重复性好等优点。研究了酶解前蛋清热处理对水解度（DH）的影响,结果发现在酸性条件下热处理的蛋清对酶的抑制作用没有显著降低,而碱性条件下热处理可显著去除蛋清对蛋白酶的抑制作用。圆二色性测定发现热处理后蛋清形成了以β-折叠和无规卷曲为主的二级结构,蛋清经热处理引起的蛋白质的二级结构变化对DH的影响不大。蛋清水解度DH的提高主要是因为蛋清抑制蛋白酶作用的丧失引起的。通过静态吸附和解吸实验,确定了DA201-C大孔树脂为EWPH的最佳脱盐树脂,对等量吸附焓变的测定发现DA201-C大孔树脂吸附EWPH是一种吸热的物理吸附过程。通过比较水解蛋清蛋白的能力,筛选得到Alcalase和Protease N两种蛋白酶。Protease N水解物和Alcalase水解物的氨基酸组成相似,氨基酸评分比天然蛋清高,游离氨基酸含量很少,然而Protease N水解物比Alcalase水解物具有更高的抗氧化和抗凝血酶活性,最终确定了Protease N为蛋清蛋白水解用酶。EWPH的疏水性与抗氧化活性的关系不大,与抗凝血酶活性具有一定相关性。具有最高抗氧化活性的EWPH的相对分子质量分布范围主要在2494100之间。EWPH的氨基酸的极性大小和带电荷性质同抗凝血酶活性紧密相关。经过胃肠道消化酶的处理后,EWPH的抗氧化和抗凝血酶活性保持较好。利用人工神经网络对EMBR的酶解过程进行了控制和仿真,实现了对EMBR制备活性肽的预测和模拟。EMRB抗凝血酶产物的氨基酸评分为113.25,第一限制氨基酸为苏氨酸,游离氨基酸含量为0.39%（w/w）,产物中28个氨基酸组成的肽的相对含量接近80%。采用大孔树脂吸附层析、凝胶层析、半制备RP-HPLC、分析型RP-HPLC分离得到四个具有抗凝血酶活性的组分。采用串联质谱从四个组分里分析得到17个肽的氨基酸序列,它们富含疏水氨基酸和碱性氨基酸。对其中的Leu-Val-Phe-Lys活性肽进行了合成,证明其具有抗凝血酶活性,抑制类型为可逆抑制。运用分子对接理论研究了肽Leu-Val-Phe-Lys的构效关系,发现对接后的配体结构与凝血酶空腔中的亲水-疏水区域形成了较好的匹配。肽链上增加疏水性侧链有助于增加配体分子对接过程中的脱溶作用以及疏水相互作用。结合能计算表明,增加肽链上的正电荷将有助于与凝血酶活性腔的氨基酸残基形成静电匹配,增强两者之间的结合力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 鸡蛋与蛋清
• 1.1.1 鸡蛋
• 1.1.2 蛋清的化学组成
• 1.2 蛋清的研究现状
• 1.2.1 提取溶菌酶
• 1.2.2 蛋清的冷杀菌技术
• 1.2.3 蛋清的功能性质
• 1.2.4 蛋清酶水解物
• 1.3 生物活性肽研究进展
• 1.3.1 抗凝血肽研究进展
• 1.3.2 抗氧化肽的研究进展
• 1.4 本课题的立题背景和研究意义
• 1.4.1 鸡蛋的深度开发和利用，增加鸡蛋附加值
• 1.4.2 制备具有确切生物活性功能的活性肽，开发功能性配料
• 1.5 主要研究内容
• 参考文献
• 第二章 抗凝血酶活性测定方法的建立
• 2.1 前言
• 2.2 材料和仪器
• 2.2.1 原料
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 凝血酶效价的测定
• 2.3.2 纤维蛋白原含量的测定
• 2.3.3 方法原理
• 2.3.4 测量波长的确定
• 2.3.5 pH 值的确定
• 2.3.6 NaCl 浓度的确定
• 2.3.7 未加抑制物的吸光值测定
• 2.3.8 添加抑制物的吸光值测定
• 2.3.9 EWPH 对凝血酶的抑制率Y 和抑制活性αi 的计算
• 2.3.10 可信度判断
• 2.3.11 测定方法的适用范围
• 2.3.12 灵敏度测定
• 2.3.13 重复性测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 纤维蛋白原含量
• 2.4.2 纤维蛋白凝固物的测定波长
• 2.4.3 pH 对吸光值的影响
• 2.4.4 NaCl 浓度对吸光值的影响
• 2.4.5 可信度判断
• 2.4.6 测定方法的适用范围
• 2.4.7 灵敏度和重复性
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 蛋清酶解前的热处理与水解物的脱盐方法研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 蛋白酶的活力测定及酶活残留率计算
• 3.3.2 蛋白质含量的测定
• 3.3.3 天然蛋清对酶抑制作用的测定
• 3.3.4 在不同pH 下热处理的蛋清对酶抑制作用的测定
• 3.3.5 在不同温度下热处理的蛋清对酶抑制作用的测定
• 3.3.6 不同pH 下热处理蛋清的制备
• 3.3.7 不同温度下热处理蛋清的制备
• 3.3.8 蛋清的水解与水解度的测定
• 3.3.9 圆二色性（Circular dichroic，CD）测定
• 3.3.10 大孔吸附树脂的预处理
• 3.3.11 静态吸附试验
• 3.3.12 静态解吸试验
• 3.3.13 DA201-C 大孔吸附树脂对EWPH 的静态吸附动力学
• 3.3.14 DA201-C 大孔吸附树脂对EWPH 吸附行为的热动力学
• 3.3.15 数据处理
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 天然蛋清对酶的抑制作用
• 3.4.2 不同pH 下热处理后蛋清的溶解性
• 3.4.3 不同pH 值下热处理后的蛋清对蛋白酶的抑制作用
• 3.4.4 不同温度热处理后的蛋清对蛋白酶的抑制作用
• 3.4.5 热处理的起始pH 值和温度对DH 的影响
• 3.4.6 蛋白质的二级结构对DH 的影响
• 3.4.7 对EWPH 的静态吸附
• 3.4.8 对EWPH 的静态解吸
• 3.4.9 DA201-C 大孔吸附树脂对EWPH 的静态吸附动力学
• 3.4.10 DA201-C 大孔吸附树脂对EWPH 的吸附热力学
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 蛋清蛋白水解酶的筛选及其水解物的生化特性研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料和仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 酶活的测定
• 4.3.2 水解蛋白酶水解蛋清能力的比较
• 4.3.2.1 底物溶液的配制
• 4.3.2.2 水解方法
• 4.3.2.3 pH-stat 法
• 4.3.3 不同DH 的蛋清蛋白水解物（EWPH）的制备方法
• 4.3.4 DH 计算
• 4.3.5 EWPH 的脱盐
• 4.3.6 抗氧化活性测定
• 4.3.6.1 对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除作用
• 4.3.6.2 对羟基自由基（·OH）的清除作用
• 4.3.6.3 对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除作用
• 4.3.7 抗凝血酶活性
• 4.3.8 蛋白质含量测定
• 4.3.9 不同疏水性的EWPH 组分的制备
• 4.3.10 凝胶过滤层析分离组分的制备
• 4.3.11 氨基酸分析
• 4.3.12 游离氨基酸分析
• 4.3.13 相对分子质量分布测定
• 4.3.14 水解物的疏水值计算
• 4.3.15 体外模拟消化实验
• 4.3.16 数据处理
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 不同蛋白酶水解蛋清能力的比较
• 4.4.2 不同DH 的EWPH 的抗氧化活性
• 4.4.2.1 对DPPH·的清除能力
• 4.4.2.2 对·OH 的清除能力
• 4.4.2.3 对O2·-的清除能力
• 4.4.3 不同DH 的EWPH 的抗凝血酶活性
• 4.4.4 两种EWPH 的氨基酸组成及营养评价
• 4.4.5 两种EWPH 的游离氨基酸组成
• 4.4.6 两种EWPH 的相对分子质量分布
• 4.4.7 抗氧化活性组分的疏水性质
• 4.4.8 抗凝血酶活性组分的疏水性质
• 4.4.9 活性组分的相对分子质量分布
• 4.4.10 抗凝血酶活性组分的氨基酸组成分析
• 4.4.11 抗氧化活性与氨基酸组成的相关性
• 4.4.12 峰2 和峰3 的相对分子质量分布
• 4.4.13 体外消化对EWPH 的生物活性的影响
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 酶膜生物反应器制备蛋清蛋白活性肽的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料和仪器
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 酶解工艺流程
• 5.3.2 正交试验设计
• 5.3.3 BP 人工神经网络的设计及对实验数据的拟合
• 5.3.3.1 人工神经网络学习样本的选择与设计
• 5.3.3.2 BP 人工神经网络设计
• 5.3.3.3 BP 人工神经网络对酶解过程的优化
• 5.3.4 蛋白质含量测定
• 5.3.5 抗凝血酶活性测定
• 5.3.6 抗氧化活性测定
• 5.3.7 氨基酸分析
• 5.3.8 游离氨基酸分析
• 5.3.9 相对质量分布分析
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 正交试验结果
• 5.4.2 极差分析
• 5.4.3 人工神经网络的预测与优化
• 5.4.3.1 BP 网络的训练
• 5.4.3.2 神经网络对酶解过程的优化
• 5.4.4 EMBR 抗凝血酶产物的氨基酸分析及营养评价
• 5.4.5 游离氨基酸分析
• 5.4.6 相对分子质量组成
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 第六章 抗凝血酶活性肽的分离纯化及构效关系研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与设备
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 仪器
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 凝血酶抑制率测定
• 6.3.2 蛋白质含量的测定
• 6.3.3 大孔吸附树脂层析分离活性肽
• 6.3.4 凝胶层析分离活性肽
• 6.3.5 半制备RP-HPLC 分离活性肽
• 6.3.6 分析型RP-HPLC 分离活性肽
• 6.3.7 MALDI-TOF-TOF MS 测定活性肽结构
• 6.3.8 合成的活性肽分离纯化
• 6.3.9 抗凝血酶活性肽抑制类型测定
• 6.3.10 分子对接模型的构建
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 大孔吸附树脂层析分离EWPH
• 6.4.2 Sephadex G-15 凝胶层析分离M75 组分
• 6.4.3 半制备RP-HPLC 分离M75-G4
• 6.4.4 分析型RP-HPLC 分离M75-G4-R2，M75-G4-R5，M75-G4-R7
• 6.4.5 M75-G4-R2-r1, M75-G4-R5-r2, M75-G4-R7-r3, M75-G4-R7-r4 的纯度鉴定
• 6.4.6 M75-G4-R7-r3 的结构表征
• 6.4.7 M75-G4-R7-r3 抗凝血酶肽的抑制类型判断
• 6.4.8 抗凝血酶活性肽（Leu-Val-Phe-Lys）的构效关系研究
• 6.4.9 M75-G4-R2-r1、M75-G4-R5-r2、M75-G4-R7-r4 中主要母离子的结构表征
• 6.5 本章小结
• 参考文献
• 主要结论
• 展望
• 论文创新点
• 附录A 合成肽（序列Leu-Val-Phe-Lys）的鉴定报告
• 附录B M75-G4-R2-r1 组分中活性肽的MS/MS 分析图谱
• 附录C M75-G4-R5-r2 组分中活性肽的MS/MS 分析图谱
• 附录D M75-G4-R7-r4 组分中活性肽的MS/MS 分析图谱
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢