TRAIL及其相关分子在HBV感染所致凋亡改变中的机制研究

TRAIL及其相关分子在HBV感染所致凋亡改变中的机制研究

论文题目: TRAIL及其相关分子在HBV感染所致凋亡改变中的机制研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 免疫学

作者: 张秋

导师: 孙汶生

关键词: 凋亡,配体,乙型肝炎病毒,肝细胞

文献来源: 山东大学

发表年度: 2005

论文摘要: 乙型肝炎病毒(HBV)是一个与肝炎、肝癌形成密切相关的致病因子,其致肝脏损伤以及细胞恶性变的机制迄今尚未完全阐明。乙肝病毒感染后所导致的机体免疫调节功能紊乱及肝细胞凋亡的失衡,是造成肝脏不同类型的病理变化及临床转归的主要原因之一。探讨HBV与机体免疫监视分子的相互作用机制,对于进一步理解HBV的致病机理和探索有效的治疗方案有着重要意义,是一个十分有研究价值的问题。 TNF相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)、TNF相似的凋亡诱导分子(TNF-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)是继FasL之后发现的TNF家族中的新成员,具有其独特的凋亡诱导特性。它们分布广泛,对正常生理状态下的机体组织没有毒性,而只是在病理状态下被激活来参与机体的免疫反应。但是,作为机体的免疫监视分子和免疫效应分子,TRAIL、TWEAK是否参与了HBV的致病过程,及其在HBV相关疾病中的作用机制至今尚不清楚。我们率先开展了此项研究,并取得了一定的研究成果。 目的: 1.研究HBV转染对TRAIL诱导细胞凋亡的影响及其机制。 2.研究IFN-γ/对TRAIL诱导HBV转染细胞凋亡的影响,并初步探讨其机制。 3.研究TRAIL-TRAIL受体系统在慢性乙肝患者外周血单个核细胞凋亡中的作用,探讨它与临床分期、肝脏损伤程度的关系。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

符号说明

前言

总体技术路线

第一部分 HBV转染对TRAIL诱导凋亡的影响及机制探讨

第一节 含1.1倍、3.0倍HBV全基因组真核表达载体的构建及表达

技术路线

材料与方法

1.材料

2.方法

2.1 质粒p3.6Ⅱ、pUC19-3.0HBV、pcDNA3的转化、扩增与提取

2.1.1 E.coli DH5α感受态的制备

2.1.2 质粒p3.6Ⅱ、pUCl9—3.0HBV和pcDNA3的转化

2.1.3 碱变性法小量制备质粒DNA

2.1.4 碱裂解法大量制备质粒DNA和聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA

2.1.5 试剂盒小量提取质粒

2.2 质粒p3.6Ⅱ、pUC19—3.0HBV的酶切及目的基因片段的回收、纯化

2.2.1 质粒p3.6Ⅱ、pUC19—3.0HBV的酶切

2.2.2 目的基因片段的回收与纯化

2.2.3 载体pcDNA3的线性化和5′端去磷酸化修饰

2.3 目的基因与载体的连接、转化及初步鉴定

2.3.1 目的基因与载体的连接

2.3.2 感受态细菌的制备

2.3.3 重组质粒的转化

2.3.4 阳性重组子的筛选鉴定

2.4 目的基因插入方向的鉴定和序列分析

2.4.1 酶切鉴定目的基因的插入方向

2.4.2 DNA自动测序与序列分析

2.5 重组质粒稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定

2.5.1 BEL-7402、HepG2细胞的传代培养

2.5.2 基因转导

2.5.3 克隆筛选

2.5.4 稳定筛选细胞的鉴定

结果

1.质粒p3.6Ⅱ、pUC19-3.0HBV、pcDNA3的酶切鉴定

1.1 p3.6Ⅱ、pcDNA3的酶切鉴定

1.2 pUC19-3.0HBV、pcDNA3的酶切鉴定

2.pcDNA3-1.1HBV、pcDNA3-3.0HBV真核表达载体的构建及鉴定

2.1 目的基因和载体的酶切回收

2.2 目的基因与载体的连接、转化

2.3 目的基因插入方向的鉴定和序列分析

2.3.1 阳性重组子的酶切鉴定

2.3.2 DNA测序及序列分析

3.重组质粒稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定

3.1 肝癌细胞BEL-7402、HepG2的培养

3.2 阳性细胞克隆的筛选

3.3 稳定筛选细胞的鉴定

3.3.1 HBpreS2、HBx mRNA表达的检测

3.3.2 HBsAg、HBeAg表达的检测

讨论

第二节 HBV转染对TRAIL诱导凋亡的影响

材料与方法

1.材料

2.方法

2.1 CCK-8检测TRAIL对细胞生长的抑制效应

2.2 TUNEL检测TRAIL诱导的凋亡效应

2.3 Caspase3活性检测分析TRAIL诱导的凋亡

2.4 DNA Ladder检测TRAIL诱导的细胞的凋亡

2.5 Western blot检测Caspase3前体表达分析TRAIL诱导的凋亡

2.5.1 细胞的准备

2.5.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.5.3 Western blot检测Caspase3前体蛋白的表达

结果

1.HBV转染增强TRAIL对细胞的生长抑制效应

2.HBV转染促进TRAIL诱导的细胞凋亡

2.1 TUNEL检测结果

2.2 Caspase3活性的检测结果

2.3 DNA Ladder检测结果

2.4 Caspase3前体蛋白的表达

讨论

第三节 HBV转染促进TRAIL诱导凋亡的机制研究

技术路线

材料与方法

1.材料

2.方法

2.1 胞外水平的检测

2.1.1 半定量RT-PCR检测TRAIL受体的表达

2.1.1.1 引物的设计与合成

2.1.1.2 RT-PCR

2.1.2 流式细胞术检测TRAIL受体的表达

2.2 胞内水平的检测

2.2.1 线粒体非依赖途径的检测

2.2.1.1 Western blot检测Caspase8前体的表达

2.2.2 线粒体依赖途径的检测

2.2.2.1 Western blot检测Caspase9前体的表达

2.2.3 凋亡通路中调节分子的检测

2.2.3.1 Western blot检测Bax的表达

2.2.3.2 Westetn blot检测FLIP的表达

2.2.3.3 双荧光素酶报告基因系统检测NF-κB的活性

结果

1.HBV转染前后TRAIL受体的表达差异研究

1.1 TRAIL受体mRNA的表达

1.2 TRAIL受体蛋白的表达

2.HBV转染前后TRAIL凋亡通路中胞内分子的差异研究

2.1 线粒体非依赖途径

2.2 线粒体依赖途径

2.3 凋亡通路中调节分子的比较

讨论

第四节 IFN-γ对TRAIL诱导HBV转染细胞凋亡的影响及机制研究

技术路线

材料与方法

1.材料

2.方法

2.1 TUNEL检测IFN-γ联合TRAIL诱导的细胞凋亡

2.2 半定量RT-PCR检测TRAIL受体的表达

2.3 半定量RT-PCR检测凋亡抑制分子FLIP mRNA的表达

结果

1.IFN-γ促进TRAIL诱导的HepG2/1.1HBV凋亡

2.IFN-γ对HepG2/1.1HBV细胞TRAIL受体表达的影响

3.IFN-γ对HepG2/1.1HBV细胞中凋亡抑制蛋白FLIP表达的影响

讨论

第五节 慢性乙肝患者外周血单个核细胞TRAIL受体的表达及意义

材料与方法

1.材料

2.方法

2.1 RT-PCR检测外周血单个核细胞TRAIL受体的表达

2.2 流式细胞术检测外周血单个核细胞TRAIL受体的表达

2.3 肝功能测定

2.4 统计学处理

结果

1.外周血单个核细胞TRAIL受体的表达

2.慢性乙肝患者外周血单个核细胞DcR1的表达与临床分期的关系

3.慢性乙肝患者外周血单个核细胞DcR1的表达与临床指标的相关性

讨论

小结

第二部分 HBV转染对TWEAK诱导凋亡的影响及IFN-γ对TWEAK诱导凋亡的调节

材料与方法

1.材料

2.方法

2.1 CCK-8检测TWEAK对细胞生长的抑制效应

2.2 TUNEL检测TWEAK诱导的细胞凋亡

2.3 TUNEL检测IFN-γ联合TWEAK诱导的细胞凋亡

结果

1.HBV转染增强TWEAK对细胞生长的抑制效应

2.HBV转染促进TWEAK诱导的细胞凋亡

3.IFN-γ促进TWEAK诱导的BEL-7402/1.1HBV、HepG2/1.1HBV凋亡

讨论

小结

附图

参考文献

致谢

博士在读期间发表论文及论著目录

学位论文评阅及答辩情况表

发布时间: 2005-10-17

参考文献

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