HMGB1与宫颈癌转移的相关性研究

论文摘要

目的高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1, HMGB1）在肝癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌等多种高转移性的恶性肿瘤中高表达,与肿瘤的发生、转移和血管生成密切相关。最近研究发现,HMGB1与原发肿瘤中的淋巴管密度有关,并且血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C）的表达与HMGB1的表达呈正相关。宫颈癌是一种,转移能力较强的肿瘤,早期即可出现淋巴道转移。我们前期研究发现,HMGB1在宫颈鳞癌组织高表达,并与临床分期和淋巴结转移密切相关；HMGB1在宫颈癌HeLa细胞内高表达,将siRNA质粒瞬时转染HeLa细胞后,HMGB1mRNA和蛋白表达受到抑制、HeLa细胞生长变慢、细胞周期停滞在G2期。本研究继续探讨RNA干扰HMGB1基因表达后对宫颈癌HeLa细胞增殖、侵袭和迁移的影响；初步探讨外源性HMGB1对人淋巴管内皮细胞体外淋巴管生成的作用,为体内HMGB1在促进肿瘤淋巴管生成进而加速淋巴管转移上的可能作用提供理论依据。方法1.采用脂质体介导将前期实验中已经构建的HMGB1siRNA质粒PGCsi3.0-1和阴性对照质粒PGCsi3.0-Neg转染宫颈癌HeLa细胞,采用G418筛选阳性单克隆细胞并扩大培养。2. RT-PCR和Western blot检测转染前后的HeLa细胞中HMGB1mRNA及蛋白表达水平的变化,分析RNA干扰效果。3.MTT检测siRNA干扰HMGB1表达后对HeLa细胞增殖能力的影响。4.细胞划痕实验检测siRNA干扰HMGB1表达后对HeLa细胞体外迁移能力的影响。5. Trans well小室模型实验检测siRNA干扰HMGB1表达后对HeLa细胞体外侵袭能力的影响。6.培养人淋巴管内皮细胞,不同浓度人重组HMGB1 （human recombinant HMGB1,hrHMGB1）处理人淋巴管内皮细胞,同时人重组VEGF-C （human recombinant VEGF-C, hrVEGF-C）作为阳性对照,采用MTT检测人淋巴管内皮细胞的体外增殖能力。7.Transwell小室模型实验检测不同浓度hrHMGB1和hrVEGF-C处理人淋巴管内皮细胞前后的细胞体外迁移能力。8. Matrigel模型实验检测不同浓度hrHMGB1和hrVEGF-C处理人淋巴管内皮细胞前后细胞体外成管能力。结果1. HMGB1 siRNA质粒成功转染HeLa细胞,于转染后48h达最高转染效率,通过G418稳定筛选单克隆细胞扩大培养,得到HMGB1稳定降表达的HeLa细胞株。2.通过RNAi可显著抑制HeLa细胞中HMGB1mRNA和蛋白表达。3.RNA干扰HMGB1表达后,HeLa细胞体外生长减慢、迁移率降低、穿膜细胞数减少。4.经rHMGB1处理后,人淋巴管内皮细胞体外增殖能力、迁移能力和成管能力均增强,并呈现剂量和时间依赖性；rVEGF-C显著促进人淋巴管内皮细胞体外增殖、迁移和成管。结论1. RNAi沉默HMGB1基因后可显著抑制HeLa细胞体外增殖、侵袭和迁移能力,提示HMGB1可作为宫颈癌基因治疗的有效靶点并且RNAi可能为宫颈癌基因治疗开辟新思路。2. HMGB1和VEGF-C均为淋巴管生成因子,可通过促进淋巴管生成而加速肿瘤细胞淋巴道转移,为宫颈癌的侵袭转移机制研究提供新的理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、RNAi对宫颈癌HeLa细胞HMGB1表达的影响
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 细胞培养和细胞转染
• 1.1.2 RT-PCR检测HeLa细胞中HMGB1mRNA表达
• 1.1.3 Western blot检测HeLa细胞中HMGB1蛋白表达
• 1.2 结果
• 1.2.1 HeLa细胞转染效率和G418筛选单克隆细胞
• 1.2.2 RT-PCR结果分析
• 1.2.3 Western blot结果
• 1.3 讨论
• 1.3.1 RNAi的作用原理
• 1.3.2 RNAi的实现方法
• 1.3.3 HMGB1与肿瘤
• 1.3.4 HMGB1siRNA干扰与宫颈癌基因治疗
• 1.4 小结
• 二、RNAi对HeLa细胞生物学行为的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料和主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 MTT检测细胞生长情况
• 2.2.2 细胞划痕试验检测迁移能力
• 2.2.3 体外侵袭实验
• 2.3 讨论
• 2.3.1 HMGB1对HeLa细胞增殖能力的影响
• 2.3.2 HMGB1对HeLa细胞侵袭和迁移能力的影响
• 2.3.3 HMGB1与宫颈癌基因治疗
• 2.4 小结
• 三、HMGB1对宫颈癌转移相关淋巴管生成的作用
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 细胞株和培养基
• 3.1.2 材料和主要试剂
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 细胞培养
• 3.2.2 MTT实验结果
• 3.2.3 Transwell小室迁移实验结果
• 3.2.4 Matrigel模型LECs成管实验
• 3.3 讨论
• 3.3.1 VEGF-C与淋巴管生成
• 3.3.2. HMGB1与淋巴管生成
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 HMGB1在肿瘤靶向治疗中展望
• 综述参考文献
• 致谢