水稻白叶枯病隐性抗病基因xa13的分离与鉴定

论文摘要

植物抗病基因的研究一直以来是植物分子生物学研究领域的热点之一，迄今已经从不同的宿主中分离了50多个抗病基因，其中仅有6个是隐性基因，这些隐性抗病基因的作用机理目前尚不能用广为接受的显性基因的作用机理来进行解释。水稻中已经鉴定32个主效抗白叶枯病基因，其中9个为隐性抗病基因。位于第8染色体长臂末端的xa13基因就是其中的一个典型，它完全隐性抗性、特异性的抗白叶枯病菌菲律宾菌系生理小种6（PXO99）、和其它显性或隐性抗白叶枯病基因存在抗性互作，说明xa13基因抗病机理的特异性。 为克隆xa13基因，采用基因组饱和杂交的原理，在9个发育时期取材构建了水稻品种明恢63全生育期均一化cDNA文库。以分子标记E6a和另一端标记S14003为起始，构建了xa13基因区段的物理图谱，并结合3个F2群体和Shotgun测序结果将该基因定位于一个9.2kb的DNA片段上。同时通过精细物理定位xa13基因，开发了数个与该基因紧密连锁的基于PCR技术的分子标记，为采用分子标记辅助选择xa13育种提供了经济、方便的分子标记。 在优化了一套适合于水稻品种IRBB13的转基因组培体系的基础上，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将携带显性候选基因的片段转入到携带隐性抗病基因的水稻品种IRBB13中，在45株转基因植株后代中，有全长基因导入的30株的表型变为感病，并且4个单拷贝转基因的T1代家系也符合共分离检测，从而验证了候选基因是xa13基因的显性基因Xa13，标志用图位克隆法成功克隆了隐性基因xa13和显性基因Xa13。同时，通过RNA干扰（RNAi）技术，分别抑制水稻品种明恢63和中花11中显性基因Xa13的表达，以及水稻品系IRBB13中隐性基因的表达。通过接种白叶枯病菌PXO99和定量RT-PCR分析发现，明恢63和中花11中Xa13基因表达受到抑制的植株表型由感病变为抗病，IRBB13中xa13基因表达受到抑制的植株抗性进一步加强。 有趣的是，显性基因Xa13和隐性基因xa13在花药中的表达量高于在叶片中的表达量。RNAi转基因植株中Xa13或xa13的表达受到抑制会导致植株不育或半不育，组织学观察发现这些不育单株的多数花粉的发育停留在单核花粉期或二核花粉期。原位杂交的实验证明，Xa13基因在花药中表达的时期与异常花粉发生的时期非常一致，Xa13在花粉发育的早期不表达，在单核花粉期开始高水平表达。从而说明Xa13基因在花粉的发育中也起着重要的作用。 进一步通过大量实验表明，显性基因Xa13是一个受病原调控表达的基因，由显性基因Xa13突变成隐性基因xa13的关键不是编码区内的变化，而是在启动子区的一个约18bp的区间内的突变使基因表达受病原调控的能力丧失，且这种突变不影响其在花粉中的表达。XA13蛋白是一个未知具体生化功能的细胞膜蛋白，属于MtN3家族的成员之一。但其在白叶枯病菌PXO99侵染以及在花粉的发育中发挥着重要的功能，且可能介导新的抗病途径。因此，本研究通过克隆隐性基因xa13以及它的显性基因Xa13，不

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 水稻白叶枯病的发生和分布
• 1.2 水稻白叶枯病的症状
• 1.3 水稻白叶枯病病原菌的研究
• 1.3.1 稻白叶枯病病原菌的命名
• 1.3.2 Xoo的形态学特征和理化性质
• 1.3.3 Xoo致病型的划分
• 1.3.4 致病性的研究和致病机理的探索
• 1.3.4.1 白叶枯病菌的侵染和繁殖
• 1.3.4.2 白叶枯病菌毒性的相关研究
• 1.3.4.3 白叶枯病菌激发宿主抗性和无毒基因的研究进展
• 1.4 水稻抗白叶枯病的研究
• 1.4.1 种质资源的发掘
• 1.4.2 抗白叶枯病基因的遗传研究
• 1.4.3 抗白叶枯病基因的分离与克隆
• 1.4.3.1 基因分离克隆的方法
• 1.4.3.2 Xa21基因与其基因家族
• 1.4.3.3 Xa1基因的克隆
• 1.4.3.4 Xa26基因的克隆和基因家族
• 1.4.3.5 xa5基因的克隆
• 1.4.3.6 Xa27基因的克隆
• 1.4.4 水稻抗白叶枯病的分子育种
• 1.5 植物抗病基因的研究进展
• 1.5.1 植物抗病基因类型
• 1.5.2 抗病基因的作用机理
• 1.5.2.1 “基因对基因”假说
• 1.5.2.2 防卫假说（guard hypothesis）
• 1.6 xa13基因的研究现状
• 1.7 研究目的与意义
• 2 材料和方法
• 2.1 水稻材料和接种鉴定
• 2.1.1 水稻品种与来源
• 2.1.2 群体材料
• 2.1.3 白叶枯病的接种、病情分析和细菌生长曲线的绘制
• 2.2 文库、探针和分子标记
• 2.3 菌株、质粒、载体和感受态细胞
• 2.4 DNA的提取和Southern杂交
• 2.5 RNA的操作
• 2.6 酶切、亚克隆和测序文库的构建
• 2.7 物理图谱的构建
• 2.8 扣除cDNA文库的构建
• 2.9 全生育期均一化cDNA文库的构建
• 2.9.1 独立cDNA文库的构建和质粒的扩增
• 2.9.2 DNA亲和体系的建立
• 2.9.3 cDNA文库的均一化
• 2.10 DNA测序和分析
• 2.11 农杆菌介导的遗传转化
• 2.11.1 显性基因的转化
• 2.11.2 RNAi的遗传转化
• 2.12 目标蛋白的亚细胞定位分析
• 2.12.1 通过稳定遗传转化分析目标蛋白的亚细胞定位
• 2.12.2 通过瞬时表达分析目标蛋白的亚细胞定位
• 2.13 组织学分析
• 2.13.1 花药和叶片的切片制作
• 2.13.2 花药切片的原位杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 明恢63全生育期均一化cDNA文库的构建
• 3.1.1 独立cDNA文库的构建
• 3.1.2 均一化文库的质量检测
• 3.1.2.1 文库容量、插入片段大小
• 3.1.2.2 克隆子重复概率的检测
• 3.1.2.3 基因覆盖度和全生育期特性的评估
• 3.1.2.4 低转录水平基因在均一化文库中存在的调查
• 3.2 采用图位克隆法分离xa13基因
• 3.2.1 xa13基因是完全隐性的抗病基因
• 3.2.2 xa13基因物理图谱的构建
• 3.2.3 DNA测序和基因的精细定位
• 3.2.4 候选基因的预测
• 3.2.5 显性候选基因的遗传转化与功能互补验证
• 3.2.5.1 转基因载体的构建
• 3.2.5.2 IRBB13转基因体系的建立
• 3.2.5.3 转Xa13候选基因单株的检测
• 3.2.5.4 转显性基因Xa13候选基因植株中的细菌生长
• 1代共分离检测'>3.2.5.5 转Xa13候选基因单株的T₁代共分离检测
• 3.2.6 Xa13基因的结构和功能预测
• 3.2.7 xa13基因的分离和等位基因的比较测序
• 3.2.8 采用RNAi技术研究xa13基因的功能
• 3.2.9 Xa13基因的表达受到病原的调控
• 3.2.10 Xa13和xa13基因启动子区的比较测序
• 3.2.11 XA13蛋白亚细胞定位分析
• 3.3 xa13基因介导的抗病途径的初探
• 3.3.1 病程相关类基因的表达并非xa13介导的抗病反应所必需的
• 3.3.2 木质素在次生细胞壁中的累积可能不是xa13介导的抗病反应的作用途径
• 3.3.3 xa13基因介导抗病反应中的抗病相关基因表达谱分析
• 3.3.3.1 cDNA测序和聚类分析
• 3.3.3.2 EST序列的生物信息学分析
• 3.3.3.3 部分EST序列的表达分析
• 3.3.3.4 Xa21类受体激酶同源基因的表达分析和功能预测
• 3.4 Xa13基因与花粉的发育
• 4 讨论
• 4.1 全生育期均一化cDNA文库在基因研究中的应用与优化
• 4.1.1 均一化cDNA文库的应用和构建原理
• 4.1.2 基因组饱和杂交法构建均一化文库的技术优化
• 4.2 水稻抗病基因克隆方法的新变化和策略
• 4.3 显性基因Xa13和隐性基因xa13的可能作用机制
• 4.3.1 隐性基因xa13是新类型的抗病基因介导并介导新的抗病反应途径
• 4.3.2 显性基因Xa13是感病必需的基因
• 4.3.3 显性基因Xa13是花药发育必需的基因
• 4.3.4 Xa13基因为研究植物的抗病和花药发育之间的关系提供了新的起点
• 4.4 如何理解水稻对白叶枯病的抗性模式
• 4.5 隐性基因xa13的应用
• 4.5.1 分子标记聚合育种
• 4.5.2 Xa13与育性
• 5 参考文献
• 致谢
• 附录1
• 附录2
• 附录3