论文摘要
重度脓毒血症是指脓毒血症合并有器官功能障碍,与之相关的多器官功能障碍是目前重症患者的最常见的死因。脓毒血症导致多器官功能障碍的具体发病机制目前还不清楚,一般认为有多种因素发挥了作用,如微循环障碍、氧代谢紊乱、凋亡异常、细胞因子和其他脓毒血症相关因素的直接细胞毒作用等。近来,大量研究显示,细胞间氧利用障碍,即所谓“Cytopathic hypoxia”,在重度脓毒血症,特别是多器官功能障碍的发生过程中起了关键的作用。机体90%的氧是由线粒体利用的,并产生最主要的能量供应物质三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）,以维持细胞正常的生理需要和代谢平衡。电子在定位于线粒体内膜上的一系列呼吸链复合体中传递,通过氧化磷酸化反应产生ATP。因此,线粒体的功能状态很有可能是与重度脓毒血症、特别是多器官功能障碍的发生发展密切相关的。线粒体为一“半自主”细胞器,含有自身的DNA物质。线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）为双链环状DNA,全长约16,000碱基对,它包含37个基因,其中2个为rRNA基因,22个为tRNA基因,13个为蛋白质编码基因,编码线粒体呼吸链复合体上的一系列蛋白。人类mtDNA是严格母系遗传的,并可根据其编码区和控制区的一些特异性变异,将其分为不同的世系,即mtDNA单倍型类群。大量的研究表明,mtDNA单倍型类群是线粒体功能相关的,可影响线粒体呼吸链的活性,并与许多疾病如:帕金森综合症（Parkinson disease,PD）、老年性痴呆（Alzheimer disease,AD）、乳腺癌、食管癌等的发病相关。最近又有学者报道了欧洲主要mtDNA单倍型类群H是重度脓毒血症的独立预后因素,发现属于此种单倍型类群的患者,相较于非H型的个体具有更好的180天生存率（2.12倍）。虽然不同地域、种族、遗产背景的人群具有不同的mtDNA单倍型类群分布率,我们认为在其他种族中也应该存在类似重度脓毒血症和mtDNA单倍型类群之间的相关性。这样的研究,在欧洲和北美人群以外,目前相关的报道非常少。汉族人群是世界上最大的族群,约占中国总人口的93%,世界总人口的20%。大部分的汉族人群mtDNA单被型类群可以归入三个主要的mtDNA单倍型类群M、N、R（其本身为N型的分支,且为欧亚共同分支）。本研究中,我们通过建立快捷有效的mtDNA单倍型类群分型方法,检测了570例健康汉族人和相同遗传背景的181例重度脓毒血症患者的mtDNA单倍型类群类型,并前瞻性的研究了mtDNA单倍型类群与重度脓毒血症发病和预后的相关性。第一部分人类线粒体基因单倍型类群分型策略和检测方法的建立研究目的建立快速、可靠、适用于大样本量研究的mtDNA单倍型分型策略和检测方法。材料和方法选择浙江大学医学院附属第一医院体检中心健康志愿者70例。以线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）高变区序列分析结合编码区特征性变异检测验证的分型策略,特征性变异参照升级的东亚人群mtDNA单倍型类群分型树。以PCR扩增后测序分析作为高变区序列分析的检测方法,编码区特异性变异检测则由荧光标记的寡核苷酸探针在Real-time RCR AlleleDiscrimination-SNP’s模式下完成。对于以上述手段完成的mtDNA单倍型类群分型结果,用经典的限制性片段长度多态性分析（Restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP）进行验证比较。结果用mtDNA高变区Ⅰ（hypervariable segmentⅠ,HVSⅠ）序列分析结合编码区特异性变异荧光标记寡核苷酸探针验证的方法,对70例健康志愿者进行了mtDNA单倍型类群分型。对于分型结果属于mtDNA单倍型类群A、D、M7和M9的样本,用RFLP对相应特异性酶切位点进行检测,A样本出现了特征性的2个DNA片段:290bp和257bp,D型样本出现了特征性的2个DNA片段:312bp和284bp,M7型样本出现了特征型的2个DNA片段:361bp和47bp,M7型样本的限制性酶切片段中含有特征性的DNA片段:76bp和36bp。RFLP mtDNA单倍型类群的分型结果与序列分析和寡核苷酸探针分型的结果完全一致。结论mtDNA HVSI序列分析结合编码区特征性变异验证的分型策略是一兼顾敏感性和特异性的有效分型思路。荧光标记的寡核苷酸探针是检测mtDNA编码区特征性单核苷酸突变的简捷方法,敏感性和特异性好,适用于大样本研究。第二部分汉族人群线粒体基因单倍型类群与重度脓毒血症发病率的相关性研究研究目的探讨汉族人群主要mtDNA单倍型类群M、N、R与重度脓毒血症的发病率之间的相关性。材料和方法病例组来自2006年6月～11月在浙江大学医学院附属第一医院重症监护室（Intensive care unit,ICU）,急诊重症监护室（Emergency intensivecare unit,EICU）就诊并符合重度脓毒血症诊断的181例患者。健康对照组选择来自浙江大学医学院附属第一医院体检中心体检的健康志愿者570例。采用mtDNA HVSⅠ序列分析结合编码区序列特征性变异验证的方法对研究对象的mtDNA单倍型类群进行确定。结果分型结果显示:东亚人群主要mtDNA单倍型类群M、N、R在健康对照组的分布率分别为:47.7%、48.5%、37%,在重度脓毒血症病例组中的分布率分别为:47%、50.8%、36.5%。x2分析的结果显示,mtDNA单倍型类群在病例组和健康对照组中的分布率没有明显差异。在重度脓毒血症病例组中,mtDNA单倍型类群R的患者,其入组第一天的最高体温要明显高于非R型的个体（37.88±0.129℃VS 37.54±0.106℃,P=0.044）。结论汉族人群主要mtDNA单倍型类群M、N、R与重度脓血症的发病率无明显相关性。重度脓毒血症急性期,mtDNA单倍型类群R的患者相较于非R的个体具有较高的体温。第三部分汉族人群线粒体基因单倍型类群与重度脓毒血症预后的相关性研究研究目的分析汉族人群中mtDNA单倍型类群R与重度脓毒血症预后的相关性。材料和方法病例组和健康对照组同第二部分。对患者进行追踪随访,记录一般信息和基本临床资料。进行入组24小时的APACHEⅡ（Acute physiology andchronic health evaluation）评分和SOFA（Sepsis-related organ failureassessment）评分,之后每天进行SOFA评分,自至患者死亡或生存至第180天。采用先单因素分析,再多因素分析的统计原则,对可能的影响预后的临床指标以及mtDNA单倍型类群与重度脓毒血症患者的预后进行相关性分析,并以95%可信区间（Confidence interval,CI）的OR（Odds ratios）值来估计独立变量与应变量的相关性。结果对生存组与死亡组的临床资料进行比较发现,相较与死亡组,生存组患者平均年龄较低,合并慢性疾病状况少,入组24小时的APACHEⅡ评分和SOFA评分低,胸腔感染的发生率低。x2分析显示,mtDNA单倍型类群R患者的180天生存率为68.2%,明显高于其他mtDNA单倍型类群（p=0.006）。Kaplan-Meier生存分析显示mtDNA单倍型类群R患者180天生存预后要明显高于非R型的患者（p=0.0063）。mtDNA单倍型类群R患者组的基本临床状况,如年龄、有无合并慢性疾病、感染部位、入组24小时的APACHEⅡ评分和SOFA评分等,于非R型患者组相比,未发现明显差异。选取平均年龄、慢性病合并情况、感染部位、入组24小时的APACHEⅡ评分和SOFA评分和单倍型类群为变量,进行多因素Logistic回归分析显示mtDNA单倍型类群R是影响重度脓毒血症患者预后的独立因素,提示较高的生存率（OR 4.543,95%CI 1.903-10.844,p=0.001）。进一步分析还发现在病例组中必需进行辅助通气的患者,单倍型类群为R的个体,其辅助通气的最终脱机率要明显高于非R型的个体（p=0.042）。多因素Logistic回归分析mtDNA单倍型类群R是影响重度脓毒血症患者辅助通气脱机率的独立因素,提示较高的脱机率（OR 9.315,95%CI 3.014-27.684,p＜0.001）。结论汉族人群中,mtDNA单倍型类群R为重度脓毒血症预后的一个独立预测因素,具有此种mtDNA单倍型类群的个体比非R型个体有较好（4.68倍）的180天生存率。汉族人群中,属于mtDNA单倍型类群R,必须辅助通气的重度脓毒血症患者,其辅助通气的脱机率明显高于非R型患者,这种差异与总体生存率差异变化趋势一致。重度脓毒血症中,低SOFA评分和APACHEⅡ评分预示较好预后。