山羊防御素GBD-1基因克隆、表达载体的构建及鉴定

论文摘要

防御素是一种广泛存在于自然界的一类小的阳离子抗菌肽,蛋白分子量为3-6kD,富含精氨酸,具有高效、广谱抗菌活性,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、被膜病毒等有一定的杀灭效果,并且不会使微生物产生耐药性。从生物体中提取防御素则量少、成本高、步骤繁琐,因此利用基因工程的方法生产具有高效抗菌活性的防御素具有重要意义。本研究选用乌骨山羊为研究对象,提取舌组织的总RNA,采用5’RACE和3’RACE的方法扩增得到195 bp的山羊β-防御素全长cDNA序列,分析其编码的氨基酸序列行,发现在第21个氨基酸的位置有明显的信号肽切割位点。通过编码区氨基酸的序列比对发现,乌骨山羊β-防御素与波尔山羊的同源性为98%,与绵羊的同源性为93%。采用半定量PCR技术检测山羊不同组织的表达谱,结果发现山羊β-防御素（GBD-1）在消化道系统中没有检测到,而在呼吸道系统和生殖道系统有很高的表达。采用荧光定量PCR的方法定量分析山羊生殖道不同组织GBD-1的表达,发现GBD-1基因在山羊阴道、子宫颈、卵巢中表达水平较高。根据山羊p-防御素1的序列,结合毕赤酵母密码子偏好性,设计含有部分互补序列的引物,在引物两端设计EcoRⅠ和NotⅠ两个限制性内酶切位点,通过重叠PCR的方法扩增得到含38氨基酸的GBD-1基因。将鉴定正确的GBD-1基因片段连接到pPICZaA真核表达载体中,经酶切、测序鉴定正确后,用SacⅠ将重组表达质粒pPICZaA/GBD-1线性化,电转入到毕赤酵母宿主细胞GS115,用含有Zeocin的培养基筛选,并进行PCR检测。阳性的酵母重组质粒每24 h用1%浓度的甲醇诱导,然后用Tricine-SDS-PAGE电泳和Western Blot进行检测表达的蛋白,大小为4.3 kD,并证明为目的蛋白,通过BCA法测定72 h诱导后的蛋白浓度为0.315 mg/mL；利用琼脂糖孔穴扩增法进行抑菌实验发现,含重组蛋白的菌液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌效果。

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摘要

ABSTRACT

英文缩略词表

第一章文献综述

1 防御素简介与分类

1.1 防御素简介

1.2 防御素分类

2 防御素的生物学活性

2.1 抗细菌活性

2.2 抗病毒活性

2.3 抗真菌活性

2.4 免疫调节作用

2.5 细胞毒性作用

3 防御素作用机理

4 防御素应用前景展望

5 本研究的目的意义

第二章实验内容

实验一山羊防御素GBD-1基因的cDNA克隆

1 引言

2 试验材料

2.1 试验动物

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

3 试验方法

3.1 引物的设计与合成

3.2 总RNA的提取与检测

3.3 cDNA第一链的合成

3.4 RT-PCR方法扩增cDNA

4 结果与分析

4.1 总RNA的提取

4.2 GBD-1基因的序列的克隆、测序

4.3 GBD-1基因蛋白质理化性质分析

4.4 GBD-1基因同源性分析

5 讨论

实验二 GBD-1在雌性乌骨山羊不同组织中转录水平研究

1 引言

2 试验材料

2.1 试验动物

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

3 试验方法

3.1 引物设计与合成

3.2 山羊组织总RNA的提取与cDNA第一链的合成

3.3 半定量RT-PCR鉴定

3.4 荧光定量PCR鉴定

4 结果与分析

4.1 半定量RT-PCR检测结果

4.2 荧光定量RT-PCR检测结果

5 讨论

5.1 关于荧光定量PCR技术

5.2 关于不同组织表达差异

实验三山羊GBD-1表达载体的构建和鉴定

1 引言

2 试验材料

2.1 质粒、菌株

2.2 主要药品及试剂

2.3 常用试剂的配制

2.4 主要仪器设备

3 试验方法

3.1 GBD-1基因的合成

3.2 重组表达质粒的构建

3.3 GBD-1在毕赤酵母中的表达

3.4 Tricine-SDS-PAGE鉴定

3.5 Western Blot鉴定

3.6 蛋白浓度测定

3.7 抑菌实验

4 结果与分析

4.1 GBD-1的PCR扩增和序列分析

4.2 重组表达质粒的鉴定

4.3 重组表达质粒线性化检测

4.4 Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测结果

4.5 蛋白浓度检测结果

4.6 抑菌结果检测

5 讨论

5.1 酵母表达系统的选择

5.2 Tricine-SDS-PAGE

5.3 Western Blot

第三章全文结论

1 主要研究结果

2 值得进一步研究的相关问题

参考文献

致谢

在读期间发表论文情况

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