博卡病毒流行病学、致病性及基因进化研究

论文摘要

目的：腹泻病是引起全世界儿童发病和死亡的主要原因之一,轮状病毒、杯状病毒、腺病毒和星状病毒是婴幼儿腹泻的常见病毒性病原,但是仍然有相当一部分的腹泻病例检测不到确切病原,对患儿的诊断及治疗造成很大不便。人博卡病毒1-4型是近几年新发现的细小病毒,且被推测可能与腹泻有关,但是由于缺乏大量病例对照的资料,人博卡病毒究竟是婴幼儿腹泻的致病原之一,或者仅仅是肠道的“过路者”,还没有得到确切结论。本次研究拟通过病例对照研究来探讨上述疑问。方法：2006年7月至2008年6月,共收集兰州大学第一医院儿科632份住院腹泻患儿和162份健康婴幼儿的粪便标本,采用ELISA、PCR、RT-PCR等方法检测轮状病毒,杯状病毒,星状病毒及腺病毒,对阳性标本进行基因测序。采用PCR方法检测HBoV1-4型并进行基因测序,同时通过实时荧光定量PCR方法确定HBoV2病毒载量。使用SPSS11.5进行统计学分析,MEGA4.1软件包进行基因序列分析。结果：病例组标本中,轮状病毒为最常见的病原,阳性率为45.3%,其次为杯状病毒（10.1%）,星状病毒（4.9%）,和腺病毒（4.7%）。HBoV1和]HBoV3的检出率分别为27（4.3%）,6（0.9%）,HBoV4未检出。HBoV2的检出率高达20.4%（129/632）,甚至超过了杯状病毒,仅次于轮状病毒。162份对照组中,轮状病毒检出3例,星状病毒检出1例,杯状病毒和腺病毒各检出1例,HBoV1检出4例,HBoV3和HBoV4未检出,HBoV2检出率为12.3%（20/162）.摒除年龄因素的影响后,多因素回归分析结果显示HBoV1和HBoV3与婴幼儿腹泻没有疾病相关性,HBoV2与婴幼儿腹泻的疾病相关性（OR=1.269,CI=0.704-2.288）弱于轮状病毒、杯状病毒、腺病毒和星状病毒。且病例组和对照组中HBoV2的核酸病毒载量均较低,高于104 copies/ml的高病毒载量标本很少。结论：本次研究首次在中国婴幼儿腹泻标本中检测到HBoV2和HBoV3,且HBoV1-3型的流行病学特征各不相同,病例组和对照组中检出率有一定差异,通过统计学分析表明HBoV1和HBoV3与婴幼儿腹泻没有疾病相关性,HBoV2尽管具有较高的检出率,但是与婴幼儿腹泻的疾病相关性弱于常见腹泻病毒。目的：人博卡病毒2型（human bocavirus 2, HBoV2）是最近在儿童粪便标本中发现的新的细小病毒,自被发现以后在粪便标本中被频繁检出,并被认为可能是急性腹泻的致病原之一,但是在呼吸道标本中很少检出。迄今为止,所有检测HBoV2的方法均是采用巢式PCR,即费时费力又容易出现假阳性,本次研究的目的即建立高灵敏度和特异度的实时荧光定量PCR （Real-time PCR）方法用于检测HBoV2。方法：2007年11月到2008年10月在山西太原市儿童医院共收集了345份因腹泻住院的婴幼儿粪便标本,根据HBoV2 NP1基因片段保守区设计了引物和荧光探针,并使用普通PCR扩增了HBoV2 NP1基因中587bp长度片段并制备成阳性质粒作为Real-time PCR的阳性标准品,按照倍比稀释的方法稀释10个浓度梯度评估Real-time PCR方法的敏感性。同时使用Kapoor等学者设计的常规巢式PCR方法进行HBoV2检测,与Real-time PCR方法进行比较。结果：对HBoV2 NP1质粒不同浓度梯度（101-108拷贝）的DNA进行线性扩增,经评估此方法的检测低限为10个拷贝/mL。345份粪便标本分别使用Real-time PCR和常规巢式PCR方法进行HBoV2检测,使用real-time PCR方法,85（24.6%,85/345）份粪便标本为HBoV2阳性,平均病毒载量为1.02×104 copies/mL（从1.67×102 to 4.27×109 copies/mL）。使用常规巢式PCR进行检测,57（16.5%,57/345）份粪便标本为PCR电泳鉴定阳性,PCR产物测序结果显示其中52份为HBoV2,4份为HBoV1,1份为HBoV 3。19份标本为常规巢式PCR单独阳性,19份标本根据所扩增NS1片段测序结果,16份为HBoV2,16份HBoV2阳性标本使用Real-timePCR重复扩增3次,其中8份标本扩增阳性,均为其中一次阳性,且病毒载量均较低,均为10个拷贝以下（2.01×100-6.99×100 copies/mL）。结论：本次研究中我们建立了一种Real-time PCR方法进行HBoV2检测。通过使用倍比稀释的质粒DNA评估此方法的敏感性、特异性及HBoV2 DNA扩增的可靠性及可重复性,结果证明此定量扩增方法完全可行,且敏感性、特异性等性能均高于常规巢式PCR方法,是较理想的荧光定量PCR方法,为以后的HBoV2研究提供了较方便和实用的新的检测方法。目的：人博卡病毒1-4型是近几年新发现的病毒,之前的研究提出HBoV2不同亚型之间存在重组现象,HBoV3可能是HBoV1和]HBoV2的重组体,HBoV4基因组内部也存在重组现象,但是由于基因序列有限及研究方法的局限性,HBoV1-4之间确切的进化关系没有得到证实。本次研究拟针对以上不足进一步阐明HBoV1-4之间的进化关系。方法：在兰州地区收集婴幼儿腹泻病例组和对照组粪便标本,使用PCR方法检测]HBoV1、HBoV2、HBoV3及HBoV4。使用特异引物扩增HBoV2各基因片段序列,使用Genome Walking Kit扩增HBoV2基因组末端序列并拼接出完整基因组序列。使用MEGA4.1等软件整理基因序列并绘制进化树,按照序列同源性筛选出代表序列,使用RDP3等软件检测基因序列重组信号,并使用Shimodaira-Hasegawa test等方法对重组信号进行验证。结果：病例组与对照组的HBoV2 NS1片段基因序列彼此之间的同源性很高,基因进化树分析也.显示两组基因片段的拓扑结构特点具有较高的一致性。分析结果提示HBoV2不同毒株间存在重组位点,然而通过Shimodaira和Hasegawa（SH）检测,可以发现这些可能的breakpoints两侧的进化树拓扑结构并不是显著地不一致。分析结果显示HBoV1, HBoV2, HBoV3和HBoV4基因组均存在一定的重组信号,但是HBoV3存在的重组信号最强,其它3种病毒存在的重组信号较弱且没有重要意义。HBoV3可能是HBoV1和HBoV4的重组体。然而,进一步的分析发现HBoV3的VP1和VP2基因与HBoV2（?）同源性和与HBoV4的同源性相似。结论：以上结果提示兰州地区腹泻人群与健康人群中流行的HBoV2来自同一毒株,且本研究提示HBoV2可以引起婴幼儿无症状感染。尽管有证据支持HBoV2型内部的重组,但是重组信号的可信度不强,分析中出现的重组现象可能是由于其它原因引起的；HBoV3可能是HBoV和（HBoV2、HBoV4父系序列）的重组体。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分:兰州地区人博卡病毒的流行病学及致病性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分:HBoV2实时荧光定量PCR方法的建立
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分:人博卡病毒的基因组进化分析
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文
• 附录
• 致谢