单分子力测定技术用于活细胞膜蛋白表达与分布的研究

论文摘要

膜蛋白在细胞表面识别、信号转导、酶活性和物质运输等方面扮演着重要的角色,因此在活细胞水平研究膜蛋白的表达与分布情况具有重要意义。基于原子力显微镜（AFM）的单分子力测定（SMFM）技术特别适合在近生理环境下测定生物分子间的相互作用,本文利用这一技术研究了膜蛋白分子与抗体或者核酸适体的相互作用,并从纳米尺度上考察了膜蛋白分子在活细胞表面的分布情况,有利于进一步了解活细胞水平上膜蛋白分子的性质,对研究膜蛋白介导的生物过程具有重要的参考价值。本论文完成的工作包括:1.基于SMFM技术在活细胞水平上研究了细胞膜上多药耐药相关蛋白1（MRP1）的表达情况。通过测定MRP1与其抗体间的相互作用力,考察了人舌癌细胞经高剂量平阳霉素（BLM）反复间歇诱导前后细胞表面MRP1的表达差异。结果表明,MRP1与其抗体间存在特异性相互作用力,当针尖运动速率为2.5μm/s时,其大小约为182±35 pN。同时,药物诱导后MRP1在人舌癌细胞上的表达明显增强。研究结果对于了解活细胞水平上MRP1的表达提供了新的方法,有助于癌细胞多药耐药性（MDR）的研究,还有望用于活细胞水平上其他生物分子的表征。2.基于SMFM技术和激光共聚焦荧光显微技术联用,研究了乳腺癌细胞膜上肌腱蛋白C（Tenascin-C）的表达与分布情况。本工作利用SMFM技术测定了乳腺癌细胞膜上Tenascin-C与其核酸适体的相互作用,并通过AFM与激光共聚焦显微镜联用考察了Tenascin-C在乳腺癌细胞表面的表达与分布情况。结果表明,Tenascin-C与其核酸适体GBI-10存在特异性相互作用力,当针尖运动速率为2μm/s时,其大小约为190±15 pN;Tenascin-C在乳腺癌细胞表面表达较强,在正常乳腺细胞上几乎不表达。本工作拓展了SMFM技术在活细胞水平上核酸适体-蛋白质相互作用研究中的应用,有望为癌症发生、发展机制的研究提供有价值的信息。3.基于SMFM技术研究了肝癌细胞膜上Tenascin-C的表达与分布情况。由于Tenascin-C在不同组织器官上表达不同,且其往往与癌症的发生有关,因此本工作在上一工作的基础上比较了几种不同肝癌细胞株上的Tenascin-C与其核酸适体的相互作用,并通过AFM与激光共聚焦显微镜联用考察了Tenascin-C在几种不同肝癌细胞株表面的表达与分布情况。结果表明,几种不同肝癌细胞株上Tenascin-C与其核酸适体存在特异性相互作用力,当针尖运动速率为2μm/s时,其大小约为190±15 pN,与乳腺癌细胞上Tenascin-C与核酸适体的相互作用力大小一致。Tenascin-C在几种不同肝癌细胞株上均有较强表达,表达量几乎相同,在正常肝细胞株上几乎不表达。本工作的研究结果表明,采用SMFM-激光共聚焦联用技术,有利于在活细胞水平上研究核酸适体-蛋白质的相互作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 本文所用英文缩略词表
• 第1章 绪论
• 1.1 活细胞膜蛋白表达与分布的研究意义
• 1.2 活细胞膜蛋白表达与分布的研究方法
• 1.2.1 非成像方法
• 1.2.2 成像方法
• 1.3 原子力显微镜单分子力测定在生物分子相互作用中的应用
• 1.3.1 原子力显微镜概述
• 1.3.2 单分子力测定概述
• 1.3.3 原子力显微镜单分子力测定研究DNA-DNA 相互作用
• 1.3.4 原子力显微镜单分子力测定研究DNA-蛋白质相互作用
• 1.3.5 原子力显微镜单分子力测定研究蛋白质-蛋白质相互作用
• 1.3.6 原子力显微镜单分子力测定研究配体-受体相互作用
• 1.4 本论文拟开展的工作
• 第2章 单分子力测定技术研究活细胞上MRP1 的表达
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 主要试剂和仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 原子力显微镜成像
• 2.3.2 单分子力测定anti-MRP1 与MRP1 相互作用
• 2.3.3 MRP1 与anti-MRP1 间特异性相互作用力的证明
• 2.3.4 动态力谱分析anti-MRP1 与MRP1 相互作用
• 2.4 小结
• 第3章 单分子力测定技术研究乳腺细胞表面Tenascin-C 的表达与分布
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 主要试剂和仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 原子力显微镜成像
• 3.3.2 单分子力测定乳腺细胞表面Tenascin-C 与 GBI-10 的相互作用
• 3.3.3 GBI-10 与Tenascin-C 特异性相互作用的证明
• 3.3.4 AFM 与激光共聚焦显微镜联用测定乳腺细胞表面膜蛋白的表达与分布
• 3.4 小结
• 第4章 单分子力测定技术研究肝细胞表面Tenascin-C 的表达与分布
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 主要试剂和仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 原子力显微镜成像
• 4.3.2 单分子力测定肝细胞表面Tenascin-C 与 GBI-10 的相互作用
• 4.3.3 GBI-10 与Tenascin-C 特异性相互作用力的证明
• 4.3.4 AFM 与激光共聚焦显微镜联用测定肝细胞表面膜蛋白的表达与分布
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢