Orexin对慢性低压低氧模型大鼠呼吸活动的调节及机制研究

论文摘要

目的随着肥胖和代谢综合症的发病率不断升高,近年来阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合症（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS）的发病率也逐年增加。该疾病以睡眠过程中反复出现的上气道阻塞为主要特征。长期的低氧、高碳酸血症和影响睡眠质量可诱发高血压,心肌梗塞,中风等疾病。目前OSAHS发病的原因和机制还未完全阐明,哪些因素在OSAHS的发生和发展过程中影响了呼吸中枢的调节尚不明了。近来的研究发现,下丘脑合成的一种具有重要作用的神经肽--Orexin （OX,食欲素）,参与摄食、能量代谢、内分泌、心血管活动、睡眠-觉醒等多种生理功能,最新的研究还发现其可能参与了中枢对呼吸活动的调节,临床研究报告指出OSAHS患者血浆中Orexin的含量显著下降,给予患者正压通气治疗后,不仅临床症状有明显改善,患者血浆中的Orexin水平也显著上升了。另有动物实验证明：Orexin基因敲除小鼠会出现反复的睡眠呼吸暂停的现象。因此本实验利用低压氧舱处理诱导大鼠模拟OSAHS病程,观察慢性低压低氧（chronic hypobaric hypoxia, CHH）模型大鼠动脉血气、肺组织病理学、肺功能和舌下神经放电活动的改变,以及中枢OXA的表达。并进一步观察在正常大鼠下丘脑外侧区特异性损毁Orexin神经元后,肺功能和舌下神经放电活动的改变。本文研究OX对慢性低压低氧模型大鼠呼吸活动的调节作用。为进一步探讨OX在OSAHS发生和发展过程中对呼吸活动的调节机制提供实验依据。方法1.慢性低压低氧模型大鼠制备：本研究选用正常成年雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠制备慢性低压低氧模型。利用低压氧舱对大鼠进行为期28天,每天6小时的间歇性低压低氧处理（低压氧舱模拟海拔高度5000米,氧分压53.9KPa,氧浓度10%-11.2%）。并观察大鼠在舱内和出舱后的表现。2.28天造模后：（1）对CHH模型大鼠进行血气分析、肺组织病理学和肺功能测定；（2）下丘脑Orexin A神经元的免疫组织化学染色,并进行相对光密度（relative optical density, ROD）值分析；（3）舌下神经放电活动的记录；（4）上气道（喉+主支气管）的CT断层扫描,并对图像进行三维立体重建,测量上气道容积。3.特异性损毁正常大鼠下丘脑Orexin神经元,饲养两周后：（1）下丘脑尼氏染色和OrexinA免疫组织化学观察；（2）肺功能测定；（3）舌下神经放电活动的记录。结果1.观察到大鼠在入舱开始减压低氧后,即出现呼吸加快、变深、腹式呼吸明显,即早期的过度通气的生理反应；六小时出舱后观察到大鼠耳廓、足爪色泽变浅、口唇轻度紫绀等现象,表明其血氧饱和度可能降低。低压低氧28天后模型组大鼠与对照组相比,血气分析显示：pH明显下降,PCO2增加,PO2下降；肺组织病理学显示：模型组大鼠的肺组织表现为弥漫性的充血、出血、水肿；气道阻力明显增大（P<0.05,n=6）,肺动态顺应性减小（P<0.05,n=6）,潮气量减小,但无统计学差异,表明肺的通气功能下降。2.与对照组相比,模型组下丘脑Orexin A神经元的免疫组织化学染色相对光密度（ROD）值显著升高（P<0.01,n=5）。3.低压低氧28天后模型组大鼠与对照组相比,舌下神经放电的频率降低（P<0.05,n=6）和幅度变小（P<0.01,n=6）,提示舌下神经放电活动减弱。4.利用重建后的三维立体图像,测量大鼠上气道容积,对照组与模型组相比无统计学差异。5.正常SD大鼠双侧LH区注射Orexin-SAP （0.043mg/ml, 100nl/侧）两周后,尼氏染色结果显示与生理盐水对照组比较LH区的神经元数量明显减少,通过免疫组织化学实验也观察到LH的Orexin A神经元数量明显减少,仅有少量残存。应用电生理的实验技术,观察到损毁组大鼠与生理盐水对照组相比：气道阻力明显增大（P<0.001,n=6）,肺动态顺应性减小（P<0.001,n=6）。舌下神经放电的频率降低（P<0.05,n=6）和幅度变小（P<0.01,n=6）。结论1.低压氧舱能成功制作慢性低压低氧模型大鼠。2.28天的慢性低压低氧导致大鼠pH和PO2下降,CO2潴留；并引起大鼠肺的通气功能明显下降；舌下神经放电的幅度减小、呼吸频率减慢,提示舌下神经放电活动明显减弱；但还未造成大鼠上气道容积的器质性改变。3.慢性低压低氧模型大鼠下丘脑OXA神经元的合成加速,提示OXA可能参与慢性低压低氧的病理过程,其在中枢的显著增高为其参与中枢对呼吸活动的调节提供了实验证据。4.正常SD大鼠特异性损毁LH区Orexin神经元后,Orexin A神经元表达明显减少,肺的通气功能下降,舌下神经放电活动减弱。提示,Orexin神经元分泌内源性Orexin可以兴奋舌下神经、促进对上气道的控制。5.本文的结果提示Orexin神经元参与了慢性低压低氧模型大鼠OSAHS的病理生理学过程。Orexin神经元的分泌增加,可能是为了对抗慢性低压低氧引起的大鼠呼吸活动的减弱。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 1. 实验材料与仪器
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 常用试剂的配制及保存
• 1.4.1 混合麻醉剂配制
• 1.4.2 免疫组织化学常用试剂
• 2. 方法
• 2.1 慢性低压低氧大鼠模型的制备
• 2.2 大鼠肺病理形态观察
• 2.3 大鼠肺通气功能及中枢呼吸驱动评价指标的测定
• 2.4 上气道CT摄片
• 2.5 免疫组织化学方法
• 2.5.1 组织取材及切片
• 2.5.2 免疫组织化学步骤
• 2.5.3 免疫组织化学结果的图像分析
• 2.6 舌下神经放电记录
• 2.7 LH核团损毁
• 2.7.1 核团的立体定位及损毁
• 2.7.2 肺功能测定
• 2.7.3 舌下神经放电记录
• 2.7.4 尼氏染色及免疫组化
• 3. 统计分析
• 实验结果
• 1. 慢性低压低氧模型大鼠动脉血气、肺组织病理学、肺通气功能的变化
• 1.1 大鼠肺动脉血气分析
• 1.2 大鼠肺组织病理学的改变
• 1.3 大鼠肺通气功能的变化
• 2. 慢性低压低氧对于下丘脑Orexin神经元的影响
• 3. 慢性低压低氧模型大鼠舌下神经放电活动的改变
• 4. 慢性低压低氧模型大鼠CT测量上气道容积的改变
• 5. LH区Orexin神经元的损毁
• 5.1 Orexin神经元损毁后尼氏染色和免疫组织化学观察
• 5.2 损毁LH区Orexin神经元对大鼠肺功能的影响
• 5.3 损毁LH区Orexin神经元对大鼠的舌下神经放电活动的影响
• 讨论
• 1. 慢性低压低氧模型大鼠模拟OSAHS疾病病程的评价
• 2. 阻塞性睡眠呼吸暂停综合症与舌下神经的关系
• 3. Orexin参与了慢性低压低氧对呼吸活动的调节
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 附录