论文摘要
各种原因造成的软骨缺损是临床上常见的问题,由于软骨的组织学和生物学特性限制了其自身的修复能力,目前尚缺乏有效的治疗措施。组织工程技术的发展为软骨缺损的修复提供了新的手段,利用具有特定空间结构的支架材料引导软骨细胞的增殖和基质分泌,最终形成类似正常软骨组织的结构,并行使功能。近年来软骨组织工程支架的研究侧重于对材料表面的设计以提高材料的生物性能。支架表面特性对细胞/支架复合起重要作用。目前有很多方法,如碱处理、等离子放电和表面改性等都可提高材料表面的生物相容性。在支架材料的研究中,复合材料是目前研究的热点,即将两种或两种以上具有互补理化性质的生物相容性可降解材料,按一定比例和方式组合,可设计出结构与性能优化的三维支架材料。以弥补单用人工合成或天然生物材料的缺陷。本研究的目的是构建具有理想空间结构的复合支架材料,即运用快速成形技术制备的PLGA支架材料结合胶原凝胶,探讨其作为组织工程支架材料的可行性。本研究包括以下几部分内容:1制备具有生物活性的PLGA支架材料将聚酯PLGA（LA/GA=50/50）充分溶解于1, 4-二氧六环有机溶剂形成无色透明液体。采用清华大学激光快速成形中心开发研制的低温挤出成形设备-生物材料快速成形机TissFormTM,经计算机辅助设计（CAD）结合低温挤出成形工艺,在低温成形室中固化堆积,得到冷冻的三维材料。低温快速成型的方法所制备的载体框架的孔隙结构、孔隙率、力学性能符合软骨组织工程载体框架的要求,可以作为软骨组织工程的支架材料。2兔关节软骨细胞分离培养及生物活性检测运用酶消化的方法获得软骨细胞,并观察原代及传代培养的细胞形态学变化。用甲苯胺蓝及免疫组化的方法鉴定软骨细胞。成功建立体外培养兔关节软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形,传代3次后出现去分化。形态学、免疫组织化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定。本文建立的体外培养关节软骨细胞的方法简单可行。体外培养的第2代兔软骨细胞表型稳定,细胞增殖活力良好,适用于实验研究。3 PLGA及胶原改性材料与软骨细胞相容性的观察通过对原始及改性材料与软骨细胞相容性的观察,检测支架材料的生物活性。包括亲水性的测定,细胞计数,扫描电镜。实验证实,改性后材料亲水性及细胞黏附率较改性前支架均有显著性提高。4胶原凝胶包埋软骨细胞复合快速成形PLGA支架的接种方法通过将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种到快速成形的PLGA材料上并进行体外培养观察,细胞计数检测细胞粘附情况,倒置显微镜观察细胞在支架内分布的均一性。结果显示,90%以上的细胞能够有效、均匀接种于支架材料上,所以,胶原凝胶包埋软骨细胞三维接种能有效提高种子细胞的接种效率,防止细胞流失。5裸鼠体内成软骨实验通过将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种到快速成形PLGA材料的复合物植入裸鼠体内于不同时间点进行大体观察,组织学染色检查软骨形成情况。大体观察,有类软骨样组织形成,所形成的组织形态保持良好,具有一定的厚度,未见收缩。组织学结果显示软骨细胞在体内生长增殖良好,随时间延长材料逐渐降解软骨组织逐渐成熟。本实验证明低温快速成形技术制备的PLGA支架经胶原改性后具有良好的亲水性、降解性和生物相容性。凝胶包埋细胞接种支架材料的方法能够均匀、高效的将细胞固定于多孔材料中,提高细胞接种效率。同时,凝胶包埋的软骨细胞接种到快速成形的PLGA材料的复合物具有良好的成软骨能力。所以,胶原凝胶包埋快速成型PLGA支架材料可作为载体复合细胞进行软骨组织工程的研究。