论文摘要
目的探讨PLCε（phospholipaseCepsilon）基因在膀胱移行细胞癌（transitionalcelcarcmomaofthebladder，TCCB）中的表达及其与TCCB病理分期分级之间的关系。方法采用RT-PCR法检测TCCB组织及相应癌旁组织中PLCε的表达，并分析PLCεmRNA表达是否与肿瘤分期分级存在关系。结果TCCB中PLCεmRNA表达水平明显高于相应癌旁组织（P＜0.01），PLCε的mRNA表达水平与TCCB临床分期有关（P＜0.05），但与病理分级无关（P>0.05）。结论PLCεmRNA在TCCB中表达明显增高，且与临床分期相关，推测PLCε在TCCB的发生发展中有重要作用，可作为诊断TCCB的新指标。目的构建腺病毒介导的PLCε特异shRNA表达载体，观察其对膀胱癌细胞株PLCε基因表达的沉默作用，为后续研究PLCε在膀胱癌发生发展中的作用提供实验依据。方法利用PAdeasy腺病毒载体系统,将前期构建的干扰质粒pGenesil-PLCε及阴性对照质粒pGenesil-NP的表达启动子U6连同shRNA克隆至带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的穿梭质粒pAdTrack,分别酶切及DNA测序鉴定后,将重组穿梭质粒经pmeI线性化后转化入感受态AdEasier。重组pAdeasy-U6-PLCε质粒经pacI线性化后，经脂质体转染至HEK-293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-PLCε,病毒经在HEK-293中大量扩增后测定滴度,并用PCR、Westernblot及免疫荧光检测受感染膀胱癌细胞株BIU-87、T24细胞内PLCε的表达情况。结果酶切及测序鉴定证实pAdTrack-U6-PLCε及重组pAdeasy-U6-PLCε质粒构建成功,重组腺病毒Ad-U6-PLCε滴度达1.5×1012pfu/ml,受重组腺病毒感染膀胱癌细胞株BIU-87、T24细胞内PLCεmRNA及蛋白表达均明显降低（p<0.05）。结论成功构建针对PLCε基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究PLCε对膀胱癌发生发展的作用奠定了基础。目的检测Ad-U6-PLCε感染膀胱癌细胞株BIU-87、T24后对细胞侵袭力的影响并探讨相关的分子机制。方法PCR和Westernblot法检测膀胱癌细胞株BIU-87、T24细胞感染Ad-U6-PLCε后MMP-2、MMP-9和VEGFmRNA和蛋白表达的变化。同时用Westernblot检测STAT3活化情况，transwell侵袭试验检测PLCεshRNA对膀胱癌细胞侵袭能力的影响。结果Westernblot和PCR结果显示感染PLCεshRNA腺病毒后，膀胱癌细胞株BIU-87和T24的MMP-2、MMP-9和VEGFmRNA和蛋白表达均减弱，STAT3活化状态受抑制，transwell侵袭实验结果显示PLCεshRNA感染组膀胱癌细胞的侵袭力明显低于阴性对照组和未感染组。结论PLCεshRNA可能通过下调MMP-2、MMP-9和VEGF的基因和蛋白水平来抑制膀胱癌细胞的侵袭能力，可能是通过JAK/STAT3信号通路来实现的。目的探讨JAK/STAT3信号通路特异性抑制剂AG490对MMP-2、MMP-9、VEGF和P-STAT3蛋白表达以及膀胱癌细胞侵袭能力的抑制作用，以验证PLCε是否是通过JAK/STAT3通路来抑制膀胱癌细胞侵袭能力。方法分别用高、中、低三种药物浓度的AG490处理BIU-87、T24细胞株,transwell侵袭试验检测AG490对细胞侵袭能力的影响，采用Westernblot法分别检测AG490处理前后STAT3总蛋白、磷酸化形式蛋白和MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达变化。结果AG490对膀胱癌细胞侵袭力具有抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖性，AG490同样抑制P-STAT3、MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白的表达（P<0.05）。结论AG490可能通过抑制JAK/STAT3信号通路的激活，从而抑制下游MMP-2、MMP-9和VEGF的表达既而达到下调膀胱癌侵袭能力的作用。
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