IκBα-M基因诱导舌鳞癌Tca-8113凋亡的相关研究

论文摘要

研究背景：口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是口腔肿瘤中最常见的一种恶性肿瘤,占该口腔癌肿的80%。早期OSCC患者通过手术和放疗治疗效果相对较好,但对于晚期患者,尽管进行放疗、化疗和生物治疗为主的综合治疗后,5年生存率仅为20%-40%,效果尚不能令人满意[1,2]。因此如何提高晚期恶性肿瘤的治疗的成功率和患者的生存质量称为现阶段国内外相关研究的热点。核因子-KB（nuclear factor-KB, NF-κB）是一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子,具有广泛的生物学活性,激活后参与许多基因的转录调控,对细胞的存活有重要意义。在静息状态下,NF-kappaB与NF-kappa B抑制因子（inhibitor of NF-κB, IκB）结合,以无活性的形式存在于细胞质中。而激活该系统最重要的酶为位于IκB上游的IκB蛋白激酶复合物IKK（IκBkinase,IKK）。细胞在受到刺激后,IKK被激活诱导IκB降解,激活NF-κB的信号通路,抑制细胞凋亡。IκB α-M是IκBα基因突变体,将其导入细胞,表达产生IκBα-M蛋白可与p50-p65蛋白二聚体结合,而IκBα-M变异蛋白不能被IκB激酶降解,因此不受IκB激酶调节,从而阻断p65/NF-K B信号传导回路。基于此,本实验拟向Tca-8113细胞系细胞中导入IκBα-M基因并使其表达,尝试阻断p65/NF-K B信号传导回路,来诱导细胞凋亡。并尝试证实IκBα-M基因具有杀细胞作用。研究目的：对舌鳞癌细胞导入IκBα-M的基因,在不同时间点上,通过多种方法检测细胞中NF-κB信号转导通路亚单位——p65蛋白表达程度以及细胞凋亡情况,并探究两者之间的相关性。从而获得一系列图像与数据资料。为进一步的基因诱导肿瘤细胞凋亡以及最终的临床应用打下良好的基础。实验方法：实验采用人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系,细胞复苏后在37℃,5%C02的孵箱中培养。待细胞长至对数生长期后,通过顺转发用脂质体2000将工κB α-M的基因导入细胞中。转染后继续在37℃,5%C02的孵箱中培养,并在转染后的不同时间点（12h、24h、48h、72h）分别应用免疫细胞化学和Western Blotting检测信号转导蛋白p65在Tca8113细胞浆中的表达量,并同时应用流式细胞仪（Flow cytometry, FCM）和末端核苷酸转移酶介导的生物素化的dUTP末端标记法（TUNEL法）检测转染后不同剂量组的不同时间点的细胞凋亡率。实验结果：1.通过免疫细胞化学法可观察到,正常对照组细胞中P65蛋白很少出现在细胞核内,而多被定位于核周的细胞质之中；在转染后,该蛋白开始大量穿过胞膜,渐渐进入细胞核中心区域,这一过程在随着转染后时间的增加而呈现递增趋势。2.借助于western blotting,P65蛋白在细胞总蛋白中的含量被发现可随着时间逐渐发生变化,其在转染组细胞中表达量随转染后时间的增加而增加,在转染后48小时达到最大其他组中,P65蛋白表达量无明显变化。3.经过分析流式细胞检测的数据可以发现：在不同时间点上,转染后细胞凋亡率不断地改变,再48小时达到最高。其他对照组组间没有差距。4.发生凋亡的细胞在TUNEL试验中被观察到了较为典型的形态学变化,如染色体浓集、核碎裂以及凋亡小体等,凋亡细胞比率的变化趋势与流式细胞检测的结果相同。研究结论：转染IκBα-M基因,可以诱导Tca-8113细胞系的细胞凋亡,其凋亡率与转染后时间成正比,且凋亡率与P65蛋白的表达量成一直趋势。转染后,随着时间推移,P65在空间上分布位置不断变化,最终在和细胞核周期聚集。P65蛋白的表达变化和空间转移,与细胞的凋亡正相关。

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