Importin 13蛋白质介导Myopodin蛋白质入核的研究

论文摘要

生物大分子的核质转运是由受体importinβ蛋白家族成员介导完成的。在研究胚胎肺发育的过程中，发现了一个新的importinβ家族成员，命名为importin13。Importin13是目前所知的哺乳动物细胞中唯一具有双向转运功能的受体蛋白。另外研究还发现Imp13的表达受到糖皮质激素和机体发育期的双重调控，是目前所知的唯一一个受到双重表达调控的核质转运受体。通过Northern blot分析发现，importin13在胚胎肺、脑及心脏都有大量的表达，为了了解imp13在心脏中的功能，我们利用酵母双杂交系统在人的心脏cDNA文库中筛选可与importin13相互作用的蛋白质，筛选到myopodin蛋白（359-698aa）。据文献报道myopodin蛋白可能具有以下功能：1．与肌动蛋白结合形成结构蛋白；2．核质穿梭蛋白，参与信号转导；3．表达量的高低和核质分布与前列腺癌及膀胱癌的恶化有关，细胞核中Myopodin含量增加可以抑制前列腺癌及膀胱癌的转移和扩散。虽然已有文献报道importinα和14-3-3蛋白介导myopodin蛋白的入核。但importinα本身不能单独介导蛋白质的入核，而是作为importinβ家族成员的接头蛋白。因此有关myopodin如何进行核质转运的分子机理还未弄清，而myopodin在核质之间的转移与其抑制肿瘤的功能有很大关系。本论文研究了myopodin与importin13间的相互作用，并且探讨了由importin13介导的myopodin蛋白质的核质转运机制。本研究发现：1．以importin13为诱饵蛋白在人心脏文库中通过酵母双杂交筛选到与之相互作用的myopodin蛋白，并通过RT-PCR从中国人骨骼肌中获得MYOPODIN全长ORF基因。2．通过GST pull down和免疫共沉淀实验验证了importin13与myopodin之间的相互作用。3．研究内源myopodin及其不同片段myopodin与EYFP融合蛋白（F-MPD，N-MPD，C-MPD，M-MPD）以及敲除NLS的myopodin突变体在不同细胞中的定位，发现位于N-端的NLS1无核定位功能，而C-端的NLS2有较强的核定位功能，但还存在其他入核信号。4．异核体细胞融合证明myopodin是核质穿梭蛋白。5．Importin13是myopodin蛋白的入核转运受体：（1）myopodin的N端不能与importin13相互作用，间接推测importin13识别myopodin的C端；（2）突变了NLS1和NLS2的myopodin依然能与importin13相互作用，说明还存在其他入核信号；（3）Ran结合实验证明了importin13是myopodin的入核转运受体；（4）过量表达的C-importin13阻止内源myopodin的入核；（5）importin 7，importin 8，importinα2，importinβ2均不能与myopodin相互作用或作用力很弱，说明importin13是myopodin的特异转运受体。

论文目录

• 中文目录
• 英文目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词及中英文对照
• 1.前言
• 1.1 大分子物质核质转运的基本过程
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 importin β家族的结构特点与功能
• 1.1.3 核输入过程
• 1.1.4 核输出过程
• 1.1.5 核质转运模式图
• 1.1.6 Ran在核质转运中的作用
• 1.1.7 辅助因子在核质转运过程中的作用
• 1.1.8 核定位信号/出核信号的修饰作用
• 1.2 importin13的结构与功能的介绍
• 1.2.1 importin13的发现和特性
• 1.2.2 importin13在肺发育中的作用
• 1.2.3 importin13介导的核质转运
• 1.3 myopodin的研究进展
• 1.3.1 myopodin的发现
• 1.3.2 myopodin的结构与功能
• 1.3.2.1 myopodin的结构
• 1.3.2.3 myopodin的分布
• 1.3.3 myopodin的功能
• 1.3.4 myopodin的核质转运
• 1.3.4.1 myopodin在分化和胁迫条件下的核质重新定位
• 1.3.4.2 myopodin与肌动蛋白相互作用
• 1.3.4.3 myopodin的NES和NLS
• 1.3.4.4 myopodin入核机制
• 1.4 本论文的研究目的、内容和研究意义
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒列表
• 2.1.2 引物列表
• 2.1.3 抗体列表
• 2.1.4 细胞列表
• 2.1.5 药品和试剂列表
• 2.2 分子克隆
• 2.2.1 质粒载体
• 2.2.2 质粒提取和转化
• 2.2.3 质粒构建实验
• 2.2.4 PCR相关实验
• 2.3 酵母双杂交实验
• 2.3.1 醋酸锂法转化DNA入酵母
• 2.3.2 酵母样品收集
• 2.3.3 酵母培养基配制
• 2.3.4 酵母双杂交
• 2.4 生化实验
• 2.4.1 Western blotting
• 2.4.2 蛋白质浓度测定方法
• 2.4.3 蛋白质的表达和纯化
• 2.4.4 GST-Pull Down
• 2.4.5 Ran结合实验
• 2.4.6 免疫共沉淀
• 2.5 细胞相关实验
• 2.5.1 细胞培养有关试剂的配制
• 2.5.2 细胞培养基本操作流程
• 2.5.2.1 细胞复苏
• 2.5.2.2 换液
• 2.5.2.3 传代
• 2.5.2.4 细胞保种
• 2.5.2.5 细胞计数
• 2.5.2.6 接种细胞
• 2.5.2.7 瞬时转染
• 2.5.2.8 细胞染色
• 2.5.2.9 盖玻片的处理
• 2.5.2.10 裂解细胞
• 2.5.2.11 细胞融合
• 2.5.2.12 抑制蛋白出核处理
• 3.结果与分析
• 3.1 MOPODIN基因的获得
• 3.1.1 酵母双杂交分析
• 3.1.2 myopodin基因的克隆
• 3.1.3 小结
• 3.2 myopodin蛋白与importin13的相互作用
• 3.2.1 内源和外源myopodin蛋白的检测
• 3.2.2 免疫共沉淀证明myopodin与importin13的相互作用
• 3.2.3 GST Pull-Down
• 3.2.4 小结
• 3.3 myopodin蛋白在细胞中的定位
• 3.3.1 内源myopodin在不同细胞中的定位
• 3.3.2 myopodin随细胞分化在细胞核质中重新定位
• 3.3.3 胁迫条件下myopodin在核质间重新定位
• 3.3.4 内源importin13在不同细胞中的分布
• 3.3.5 外源表达的myopodin在细胞中的分布
• 3.3.6 缺失NLS的myopodin突变体在细胞中的定位
• 3.3.7 小结
• 3.4 异核体细胞验证myopodin是核质穿梭蛋白
• 3.4.1 F-myopodin和N-myopodin都是核质穿梭蛋白
• 3.4.2 小结
• 3.5 Importin13是myopodin的入核转运受体
• 3.5.1 N-末端myopodin不与imp13相互作用
• 3.5.2 已知的NLS不是myopodin与imp13的结合位点
• 3.5.3 Ran结合实验证明imp13是myopodin的入核转运受体
• 3.5.4 Myopodin与importinβ其他成员无相互作用
• 3.5.5 过量表达的C-imp13阻止内源myopodin入核
• 3.5.6 小结
• 3.6 讨论
• 3.7 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历