论文摘要
第一部分体外SAHA对MSCs向心肌细胞分化的诱导促进作用目的:探讨异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA）体外诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是否促进其向心肌细胞分化,以及SAHA与5氮杂胞苷（5-azacytidine, 5-aza）是否存在协同作用。方法:提取扩增大鼠MSCs,分别以SAHA、5-aza或SAHA+5-aza诱导其向心肌细胞方向分化。在分化过程中以定量聚合酶链反应（quantitative PCR, qPCR）、免疫荧光和Western blot检测心肌发育相关基因和心肌特异性蛋白的表达。结果:1. MSCs经诱导7天后心肌发育相关基因GATA4, NKx2.5和MEF2c的表达:（1）单纯SAHA诱导:GATA4, NKx2.5和MEF2c表达明显升高（p<0.05）,呈剂量依赖性,在以1μM SAHA诱导组增加最高,与未诱导MSCs比较约增加9-15倍,2μM SAHA诱导组表达相对降低。（2）单纯5-aza诱导:GATA4, NKx2.5和MEF2c表达仅增高2-4倍（p<0.05）。（3）SAHA+5-aza诱导: GATA4, NKx2.5和MEF2c表达与单纯SAHA诱导相似（p>0.05）。2.MSCs经诱导4周后心肌特异蛋白cTnT的表达:（1）单纯SAHA诱导:免疫荧光检测可见细胞内较密集的绿色点状荧光;Western blot检测1μM SAHA诱导组cTnT增加最高（p<0.05）,与未诱导MSCs比较约增加8倍,在诱导浓度为2μM时下降。（2）单纯5-aza诱导:免疫荧光检测可见细胞内稀疏绿色点状荧光,Western blot检测cTnT仅较未诱导MSCs升高1.3倍左右（p>0.05）。（3）SAHA+5-aza诱导:免疫荧光检测可见细胞内较密集的绿色点状荧光;Western blot检测cTnT升高与单纯SAHA诱导相似（p>0.05）。结论:1、SAHA可促进MSCs向心肌细胞分化,使MSCs中心肌发育相关基因和特异性蛋白表达明显升高。其诱导MSCs向心肌细胞分化效果强于单纯5-aza诱导。2、在MSCs向心肌细胞分化过程中未发现SAHA和5-aza的协同作用。第二部分体外SAHA促MSCs向心肌细胞分化的组蛋白乙酰化作用机制目的:探讨SAHA体外诱导MSCs是否通过升高心肌发育相关基因启动子DNA上结合组蛋白乙酰化水平来促进其表达,并探讨这些启动子区组蛋白高乙酰化是否与组蛋白去乙酰化酶4（histone deacetylase 4, HDAC4）抑制有关。方法:于1μM SAHA诱导MSCs 7天后收集细胞,以乙酰化H3和HDAC4抗体分别做染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）,以心肌发育相关基因第一外显子前1000bp设计引物,qPCR检测沉淀后DNA中心肌发育相关基因启动子区DNA量的变化。结果: SAHA诱导后MSCs中以乙酰化组蛋白H3抗体ChIP沉淀的GATA4、MEF2c和NKx2.5启动子区DNA分别比未诱导MSCs增加约3倍、1.4倍和2倍（p<0.05）,而以HDAC4抗体沉淀的GATA4、MEF2c和NKx2.5启动子区DNA分别比未诱导MSCs下降约0.41倍、0.31倍和0.43倍（p<0.05）。结论:1、SAHA诱导后MSCs的GATA4、MEF2c和NKx2.5表达增强可能与SAHA诱导后这些基因启动子区组蛋白乙酰化水平增加,而激活转录有关。2、GATA4、MEF2c和NKx2.5启动子区组蛋白乙酰化水平升高可能与HDAC4抑制有关。这可能也是SAHA诱导MSCs向心肌细胞特异性分化的乙酰化作用机制之一。第三部分SAHA对MSCs移植阿霉素心力衰竭大鼠心功能的影响目的:探讨SAHA诱导后MSCs移植治疗心力衰竭大鼠模型是否比单纯MSCs移植有更加明显的促进心功能改善的作用。方法:构建阿霉素心力衰竭大鼠模型,分别将MSCs、SAHA诱导7天的MSCs移植入大鼠心肌组织内,三周后心脏彩色超声心动图（ultrasonic cardiogram, UCG）检测其心功能变化,采用左室的射血分数（ejection fraction, EF）和短轴缩短率（fraction shortening, FS）指标评价移植后大鼠心功能改善情况。结果: MSCs组EF由移植前的65.92±2.98上升至移植后的73.25±3.58,FS由32.25±1.66上升至37.46±3.12。SAHA诱导MSCs组EF由移植前的66.04±2.02上升至移植后的75.13±2.05,FS由32.29±0.96上升至38.87±1.82。MSCs组和SAHA诱导MSCs组移植后与移植前心功能比较EF和FS均有明显改善（p<0.05）,但MSCs组和SAHA诱导MSCs组之间移植后心功能比较EF和FS无明显差异（p>0.05）。结论:单纯MSCs和SAHA诱导MSCs移植阿霉素大鼠心力衰竭模型心肌组织内3周后检测,两组心功能均有改善,但两组间比较无明显差异。