论文摘要
肝纤维化（hepatic fibrosis）是诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学改变,是影响慢性肝病预后的重要环节。肝纤维化为一动态过程,属可逆性病变。但若进一步发展致肝小叶结构改建、假小叶形成（肝硬化阶段）则不可逆。迄今为止,临床上还缺乏公认的确切有效的抗肝纤维化药物问世,肝纤维化的防治研究在今后一定时期内仍是国内外的热点与难点课题。细胞凋亡是机体清除不必要细胞的重要途径,维持正常组织器官的功能。在生理条件下,细胞凋亡是由基因严格控制的细胞自主的有序的死亡。在健康的生物中,为了确保正常的器官功能,通过细胞凋亡所清除的细胞数等于通过有丝分裂所产生的细胞数。然而,在病理情况下,细胞增值与细胞死亡之间的平衡被破坏,导致组织内平衡状态被打破,从而引起多种肝脏疾病的产生。现有的研究表明在急性和慢性病毒性肝炎中,往往表现为肝细胞的过度凋亡;持续性的细胞凋亡与肝纤维化、肝硬化的发生、发展密切相关;相反地,在肝细胞性肝癌中,则表现为肝细胞凋亡减少。因此,有学者提出通过调节已失衡的细胞凋亡来治疗肝脏疾病。Akt又名蛋白激酶B（PKB）。Akt能使丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）磷酸化,故又称为丝氨酸/苏氨酸激酶。Akt能介导多种生物学效应,是重要的抗凋亡调节因子。最近有学者利用Akt的这一特性来治疗一些以病理性细胞凋亡为主要病变的疾病,如:心肌缺血、阿尔茨海默病、帕金森病和肝细胞缺血再灌注损伤等,并在实验中取得了良好的效果。有鉴于此,本研究以细胞内同源重组法构建复制缺陷型重组腺病毒Ad-myr-HA-Akt,并经尾静脉途径导入大鼠体内,以研究其对CCL4诱导的大鼠肝纤维化的影响及其作用机制。方法1.方法:50只雄性SD大鼠随机分为两组,实验组（40只）采用复合因素法即:皮下注射40%四氯化碳.花生油溶液0.3ml/100g体重,每周2次。第二周开始,以10%酒精作为惟一饮料,自由饮用。饲以混有0.5%胆固醇的玉米粉饲料。对照组（10只）自由进食标准颗粒饲料及饮水,皮下注射生理盐水,频率、剂量和持续时间同实验组。8周后取肝组织行HE、VG染色。免疫印迹法检测正常大鼠和肝纤维化大鼠肝组织内Akt和p-Akt蛋白的表达。2.酶切正向插入目的基因的真核表达载体pcDNA3.1-myr-HA-Akt,获得myr-HA-Akt cDNA,然后将其定向克隆到穿梭质粒pDC316中,然后将重组质粒与病毒骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒Ad-myr-HA-Akt,并进行扩增、纯化。通过观察腺病毒感染293细胞后是否出现细胞病变效应、PCR和基因测序方法对所构建病毒进行鉴定,并采用TCID50法检测病毒滴度。重组腺病毒Ad-myr-HA-Akt自尾静脉途径感染用四氯化碳复合法制备肝纤维化模型大鼠。免疫印迹法检测大鼠肝组织内Akt和p-Akt蛋白的表达。3.取10只正常大鼠设为正常组。另取60只大鼠随机分成4组:肝纤维化组、生理盐水组、EGFP组和Akt组。采用四氯化碳复合法制备肝纤维化大鼠模型。整个造模时间为8周。生理盐水组、EGFP组和Akt组在造模第2周和第6周分别自尾静脉导入生理盐水、Ad-EGFP和Ad-myr-HA-Akt。8 wk后所有动物取肝组织标本,常规Van Gieson（VG）胶原染色,检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白（ALB）和羟脯氨酸（Hyp）。采用免疫组化方法观察各组肝组织Fas的表达情况。采用Annexin V FITC/P1流式细胞术检测各组肝细胞的凋亡。应用Western blot法检测各组大鼠肝组织内Akt、p-Akt、Fas、caspase 3、caspase 9、DR5和α-SMA蛋白的表达。EGFP组大鼠,取心、肝、脾、肺、肾、脑和睾丸,快速冰冻切片,观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果1.实验组40只大鼠造模结束时,死亡5只,死亡率12.5%。实验结束时,按照成模标准,造模成功大鼠共为28只,成模率80%。在肝纤维化大鼠肝脏内Akt的活化（磷酸化）受到了抑制。2.感染的293细胞出现了明显的细胞病变效应,PCR产物电泳证实了重组腺病毒的存在,基因测序证实myr-HA-Akt的cDNA正确插入穿梭质粒且与pBHGlox△E1,3Cre正确同源重组:病毒滴度为5.5×1011vp/ml。在蛋白水平证实感染病毒的肝纤维化模型大鼠有外源性Akt基因的表达。3.Akt重组腺病毒治疗组在应用Ad-myr-HA-Akt治疗后组织学病变减轻,免疫组化显示其Fas蛋白的表达明显低于肝纤维化组、生理盐水组和EGFP组;肝细胞凋亡率和血清ALT和AST及反映胶原沉积指标的Hyp均亦显著低于肝纤维化组、生理盐水组和EGFP组。Akt重组腺病毒治疗组p-Akt蛋白的表达明显高于肝纤维化组、生理盐水组和EGFP组,而反映细胞凋亡的Fas、caspase 3、caspase 9和HSC活化的指标DR5、α-SMA蛋白的含量则相应低于肝纤维化组、生理盐水组和EGFP组。EGFP组在Ad-EGFP转染后,肝组织中可见大量绿色荧光,肺和肾组织中仅见少量荧光,而其他实质器官未见EGFP表达。结论1.采用复合因素法可建立稳定可靠的肝纤维化大鼠动物模型,Akt可能参与肝纤维化病程。2.构建的重组腺病毒Ad-myr-HA-Akt能有效的感染肝纤维化模型大鼠,并可在肝纤维化模型大鼠中正确地转录和翻译,为进一步研究腺病毒介导的Akt基因对肝纤维化的治疗作用奠定基础。3.Akt重组腺病毒能够阻断大鼠肝纤维化的发展,可能是防治肝纤维化的一条有效途径。
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- [3].补肺颗粒通过调控Akt通路对慢阻肺大鼠肺组织自噬和凋亡的影响[J]. 武汉大学学报(医学版) 2020(06)
- [4].PI3K、AKT、PTEN在脑胶质瘤中的表达及其临床意义[J]. 卒中与神经疾病 2016(05)
- [5].Akt在药物成瘾机制中的研究进展[J]. 中国药理学通报 2017(08)
- [6].多囊卵巢综合征患者感染病原菌分布与对AKT通路蛋白的影响研究[J]. 中华医院感染学杂志 2016(07)
- [7].Akt基因在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义[J]. 现代妇产科进展 2014(12)
- [8].PI3K、AKT和PTEN在侵袭性垂体瘤中的表达和相关性研究[J]. 现代中西医结合杂志 2015(33)
- [9].胰岛素对血管内皮细胞衰老及Akt表达的研究[J]. 川北医学院学报 2013(06)
- [10].AKT和PTEN基因在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义[J]. 北京医学 2014(06)
- [11].肾透明细胞癌组织中PI3K、PTEN、AKT蛋白的表达及其临床意义[J]. 宁夏医科大学学报 2013(04)
- [12].Akt的活化对胃癌血管新生的促进作用[J]. 世界华人消化杂志 2011(07)
- [13].整合素介导的AKT信号转导途径关键酶与病理性瘢痕[J]. 医药论坛杂志 2010(05)
- [14].乳腺浸润性导管癌中AKT和VEGF-C的表达及其与淋巴道转移的相关性[J]. 肿瘤防治研究 2010(07)
- [15].子宫内膜癌组织中AKT表达及意义的研究[J]. 中国医学创新 2010(25)
- [16].AKT通路在Peroxiredoxin-1抑制转化生长因子β_1诱导肺成纤维细胞合成胶原中的作用[J]. 广东医学 2015(23)
- [17].EGFR过表达对原代肝细胞AKT的激活作用[J]. 医学研究杂志 2013(12)
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- [20].补髓生血颗粒对慢性再生障碍性贫血患者骨髓AKT磷酸化水平的影响[J]. 中医药学报 2011(02)
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- [26].PTEN和AKT在乳腺癌中的表达及临床意义[J]. 中国肿瘤 2013(06)
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- [28].二苯乙烯苷促进糖尿病大鼠心肌Akt蛋白的表达[J]. 糖尿病新世界 2015(13)
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- [30].乳腺癌组织中PTEN、AKT表达及与其临床病理及预后的相关性[J]. 实用癌症杂志 2014(05)