JZTX-XI的专一性筛选及其对hNav1.5作用机制研究

论文摘要

敬钊缨毛蛛（Chilobrachys jingzhao）是一种近些年在我国海南省发现的蜘蛛新种,这种蜘蛛的毒液对小鼠具有致命性（IC50为0.4mg/kg）。该种蜘蛛的特点是体型大,产毒量高且易于饲养,正是因此成为一种良好的系统研究蜘蛛毒素的生物材料。为了解敬钊缨毛蛛毒素的组成及其致毒机理,而且也为将来从中筛选具有开发潜力的分子,我们采取高效液相色谱和电生理技术的方法对敬钊缨毛蛛毒素活性进行全面的分析。通过阳离子交换色谱和反相高效液相色谱法（HPLC）,对敬钊缨毛蛛粗毒进行分离纯化和活性分析。钊缨毛蛛粗中的多肽类成分主要集中在分子量2-8kDa范围内,大部分含有六个Cys,三对二硫键,少数含有八个Cys四对二硫键。约有三分之一的多肽存在C末端酰胺化修饰。一大部分敬钊缨毛蛛毒素多肽与来源于其他蜘蛛的多肽毒素有较高的序列同源性,并主要是各种电压门控离子通道的抑制剂和昆虫专一性毒素。敬钊毒素-Ⅺ（JZTX-Ⅺ）就是从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化得到的一种新型肽类神经毒素,C末端酰胺化修饰,34个氨基酸残基构成的多肽其序：ECRKMFGGCSVDSDCCAHLGCKPTLKYCAWDGTF-NH,序列中含6个Cys并形成3对二硫键,其C-末端为酰胺化结尾（-CONH）。该多肽在敬钊缨毛蛛粗毒中的含量为2.31%,为该种蜘蛛毒素中的主要成分乙一。JZTX-Ⅺ是一种对通道抑制作用具有浓度依赖性和电压依赖性的。它对钾通道压型kv1、kv3、kv4几乎没有抑制作用。JZTX-Ⅺ还可以抑制心肌钠通道的电流而对其他钠通道和钙通道没有影响。在大鼠心肌细胞上的钠通道初步研究发现,JZTX-Ⅺ可以抑制大鼠心肌细胞上的钠通道的峰值电流（IC50=1.25μM）。JZTX-Ⅺ能完全抑制表达于HEK293T的钠通道亚型hNav1.5,IC50为0.44μM。并可使其的激活区向往去极化方向漂移10mV,半稳态失活曲线往超极化方向漂移8 mV,以此改变了hNav1.5的动力学特征。并且,因为JZTX-ⅩI能够力口快Nav1.5通道尾电流的去激活,暗示JZTX-Ⅺ能够导致通道从激活状态往静息状态偏移。我们推测JZTX-Ⅺ是一个通道调制型毒素,能够捕获电压敏感元件于静息状态。膜片钳研究结果显示,Nav1.5亚型的α亚基DomainⅡ的S3一S4胞外linker上的某些氨基酸残基影响了Nav1.5通道对JZTX-Ⅺ的敏感程度,数据显示,在这个linker上决定Nav1.5通道对JZTX-Ⅺ的敏感性的关键残基是Ser802、Asn803和Ser8805。此外,JZTX-Ⅺ的空间结构与本室研究的JZTX-Ⅲ结构对比表明,这两种多肽分子尽管序列差异较大,但其空间结构均为典型的工CK模体结构。两者的空间表面结构同样具有一定程度的相似,都有一个由疏水性氨基酸残基构成的疏水斑片和围绕在这个疏水斑片周围的多个带电荷残基。通过电生理实验研究表明,这一结构特征是JZTX-Ⅺ和JZTX-Ⅲ发挥生物学活性的结构基础。上述的研究我们采用高效液相层析和电生理实验技术的方法系统地研究了敬钊缨毛蛛毒素的多肽活性和部分结构特征。这项研究能使我们从分子水平进一步的了解蜘蛛毒素及其致毒机理,也为不久的将来从中筛选和开发具有药理学意义的毒素多肽奠定了一定的基础,更为JZTX-X工开发成hNav1.5离子通道和其他离子通道相关的药理学试剂提供了最直接的数据。

论文目录

• 缩写表（中英文对照）
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 电压门控钠通道及其毒素研究
• 1.1 钠通道的分类和结构
• 1.1.1 钠通道分类
• 1.1.2 电压门控钠通道结构
• 1.1.3 钠通道失活机制
• 1.1.4 通道的命名
• 1.1.5 与通道相关的疾病
• 1.2 与电压门控钠通道相互作用的毒素
• 1.3 膜片钳技术在研究钠通道和钠通道毒素中的作用
• 第二章 敬钊毒素JZTX-XI的分离纯化和初步活性筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料、仪器和方法
• 2.2.1 动物和毒素
• 2.2.2 试剂与仪器
• 2.3 敬钊缨毛蛛粗毒的分离纯化
• 2.3.1 敬钊缨毛蛛粗毒的粗分离
• 2.3.2 样品溶解和纯化
• 2.4 结果
• 2.4.1 分离纯化的色谱结果
• 2.4.2 质谱鉴定结果
• 2.5 JZTX-X工活性的专一性筛选
• 2.5.1 大鼠DRG的急性分离实验
• 2.5.2 膜片钳电生理实验
• 2.5.3 JZTX-X工对大鼠DRG细胞上的钠,钾,钙离子通道的影响
• 2.6 讨论
• 第三章 敬钊毒素JZTX-XI对各通道亚型活性筛选及其对hNav1.5相互作用的机制的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂和仪器
• 3.2.2 方法
• 3.2.3 感受态（competent cell）的制备及转化
• 3.3 离子通道在HEK293T上的表达
• 3.3.1 细胞复苏
• 3.3.2 细胞转染
• 3.4 结果
• 3.4.1 JZTX-XI对钾通道和钠通道某些亚型的活性筛选
• 3.4.2 JZTX-XI对hNav1.5通道突变体的作用
• 3.5 讨论
• 参考文献