人类肝脏JAK-STAT相互作用网络的构建

论文摘要

JAK-STAT是重要的细胞内信号转导通路,调控细胞生长、分化和凋亡等重要过程。JAK-STAT信号通路的许多成员在成人肝脏中表达,并参与肝再生、免疫等过程,不正常的JAK-STAT信号转导可致肝癌和代谢综合症,提示JAK-STAT信号转导通路在肝脏中有重要的作用。虽然信号转导研究是最热门的研究方向之一,也取得了重大成果,但相对于复杂生命现象来说,现在对信号转导的了解还是非常有限,许多重要问题仍需要更多的研究去回答和完善,如信号转导最基础的问题――每个信号转导通路究竟包含哪些成分?不同细胞不同组织器官的不同信号转导通路包含哪些成分?因此,系统构建正常成人肝的JAK-STAT信号转导通路的相互作用网络,将有利于了解成人肝JAK-STAT信号转导通路的结构特点及其复杂性,有助于研究其特异调控规律和发现它调控成人肝功能的分子机制,并为了解肝脏特殊生理功能及肝脏病理和疾病机制奠定基础。蛋白质相互作用是细胞发挥功能的基础,规模化构建和分析蛋白质相互作用连锁图有助于发现新的蛋白质功能、新的调控途径以及不同调控途径间内在联系、揭示细胞分子的作用机制。酵母双杂交方法是大规模构建蛋白质相互作用连锁图的重要方法,已成功用于规模构建酵母、线虫、果蝇、人的蛋白质相互作用网络。所以,本文以肝脏中表达的JAK-STAT信号转导通路蛋白为诱饵,采用酵母双杂交技术筛选成人肝脏cDNA文库,从蛋白质相互作用角度出发,对肝脏JAK-STAT信号转导通路进行研究。我们选取了42个基因,设计构建含不同结构域片段或全长的诱饵106个,成功构建了41个基因的98个诱饵,除去20个有自激活活性的诱饵无法筛库外,对31个基因的78个诱饵进行了肝脏cDNA文库筛选。经过报告基因表型鉴定,得到3,000多个初始阳性克隆,通过采取时序分批测序策略,送测序总克隆数大约1,480个,最后测序成功克隆数为1,384个。测序序列比对后共有24个诱饵没有获得相互作用猎物,22个基因的54个诱饵筛到了1-63个相互作用猎物,最后我们的22个基因通过筛库得到了同262个猎物的相互作用345对,平均15.6对/基因（345/22）,同人类遗传共济失调蛋白相互作用网络报道的结果18.3对/基因（770/42）接近,再次证实了通过构建一个基因的多个片段及全长诱饵进行筛库可得到较多的相互作用,一定程度弥补了严谨型酵母双杂交系统假阴性的缺陷。另外,通过对比已知相互作用对在筛库所得相互作用对的比例及分析不同表型相互作用对平均对应克隆数的结果,证实了我们采用的Y2H系统是有效的。为了降低假阳性,我们采用严谨型酵母双杂交系统进行筛库。但任何技术的大规模实验结果都不可能避免假阳性结果。为了评价数据的可信度,我们分别对技术假阳性和生物学假阳性进行了评价。对于技术假阳性我们采用酵母回转验证的方法进行评估。我们对提取得到猎物质粒的304对相互作用进行酵母回转验证,通过表型鉴定,共162对相互作用再现阳性表型,回转阳性率为53.3%。通过表型分类分析回转阳性率发现:已知相互作用的回转阳性率只有66.6%。这些表明:Y2H存在技术假阳性,同时假阴性也是本研究所使用Y2H系统一个突出问题,这提示我们需慎重对待回转呈阴性的相互作用,不能轻易的去除它们。因此,还需要借助其他实验方法,如免疫共沉淀、GST pull-down等来对技术假阳性的作评价,目前我们正在建立基于免疫共沉淀原理的芯片Co-IP技术,以便规模化地验证。在生物学假阳性评价方面,我们采用了多种生物信息学分析方法,即通过整合基因表达水平、基因敲除表型、GO功能注释、相互作用结构域、模式生物同源性比较等12项相关研究数据,以尽可能量化、全面、系统的评价。结果有32.5%（112/345）相互作用对存在相互作用结构域,1.7%（6/345）相互作用对其模式生物同源蛋白为已知相互作用,46.4%（160/345）相互作用对的猎物与诱饵共享GO共定位三级或以上注释,35.9%（124/345）相互作用对的猎物与诱饵共享GO生物学/功能三级或以上注释,11%（38/345）的相互作用对的猎物与诱饵基因表达水平相关,32.4%（112/345）相互作用在已报道网络中把其它相互作用连接成三环（three-protein-interaction loop）,56.8%（196/345）相互作用在已报道网络中把其它相互作用连接成四环（four-protein-interaction loop）,2%（7/345）相互作用对的猎物与诱饵共通路,1.5%（5/345）相互作用对的猎物在模式生物中被鉴定为JAK-STAT信号转导通路的功能相关成分（RNAi）,29.3%（101/345）相互作用对的猎物与诱饵在鼠基因敲除中表现出相似或相同的表型,2%（7/345）相互作用对的猎物与诱饵参与同类疾病。这些证据都不同程度地支持我们筛到的相互作用是可信的。为了直观判断每对相互作用的可信度和获得整体数据的可信度信息,我们整合了实验数据和各项生物信息分析数据,建立了一个包含4种实验数据和12个生物信息学分析结果共16项指标的可信度评分体系。使用该体系对每对相互作用进行可信度打分,根据得分情况将所有相互作用分为低、中、高可信度相互作用:分值在0.35-2.5的相互作用被认为是低可信度的相互作用,占所有相互作用的50.7%（175/345）;分值为2-5的相互作用被认为是中可信度相互作用,占所有相互作用的36.5%（126/345）;分值大于5的相互作用被认为是高可信度相互作用,占所有相互作用的12.8%（44/345）,后两项总共占49.3%,说明我们的相互作用约一半是具有较高可信度的相互作用。通过分等级发现,高可信度的相互作用既有前7项的物理互作证据支持,也有后面的功能相关证据支持。另外,通过对已知相互作用的分析,显示我们的评分体系可能比PRINCESS的评分体系更稳定和有效。最后,我们对所获得的相互作用进行了网络可视化分析和发现重要的相互作用。用OSPREY软件分别对已知相互作用、Y2H获得的相互作用、整合了两者的相互作用进行可视化网络构建。从所获得的网络可看出,Y2H所得到的相互作用补充和拓展了原有相互作用网络。已报道较多相互作用的诱饵筛到新的相互作用也比较多,如STAT3,新筛到58个,（同LCI网络相比）在整合网络中也可看出该中心蛋白连接的节点数变化明显,提示了STAT3在JAK-STAT信号转导通路中有相当重要的作用,其转录活性可能受到严密的调控。在新发现的相互作用网络中,我们发现各转录或信号分子之间相互连接,都各自可构成一个紧密联系的小网络,两个网络都有以NR4A1为中心形成的多个三元环和四元环结构,把几个重要转录因子和影响转录的分子联系起来,提示NR4A1在肝脏中可能有未被充分认识的重要作用;另外,我们的猎物和诱饵有65个蛋白已明确与疾病相关,说明我们所构建的Y2H相互作用网络和整合的网络可用于分析疾病的分子机制,也为未知功能蛋白给出功能提示,同时还可能发现已知功能蛋白的新功能。最后,通过OSPREY软件的观察,结合评分系统分析和文献的查找,我们发现了一些可能具有重要意义的相互作用:（1）STAT3-DVL1:这对新的相互作用分子分别是经典JAK-STAT信号转导通路和经典Wnt信号转导通路分子,可能揭示了JAK-STAT和Wnt信号转导通路间功能上紧密联系的分子机制;（2）STAT3-SIAH2:这对新的相互作用可能发现了重要蛋白STAT3细胞核内泛素化降解的E3连接酶。（3）JAK2-CHD3,这对新的相互作用可能揭示了JAK分子改变异染色质功能的分子机制,并证实JAK分子改变异染色质结构的新功能。（4） STAT3-RUNX1,STAT3-NR4A1,STAT3-ZC3H12A,这些新的相互作用提示转录分子间直接相互交谈或者形成复合物,以协同调节不同靶基因转录,应对复杂信号的刺激。总之,通过22个诱饵对正常成人肝文库进行酵母双杂交筛选,共获得345对相互作用,通过回转和评分体系分析,证实了所得的相互作用大约有50%是可信的,其中包含有系列重要的相互作用对及功能模块,为进一步的具体功能研究提供了重要素材,为了解细胞复杂分子机器的结构和功能提供了宝贵资料。这是第一次大规模系统筛查和构建人器官信号转导的相互作用网络,所得的数据为将来研究肝脏特异调控规律和了解肝脏特殊生理功能及肝脏病理或疾病机制提供了原始素材;另外,以上策略和平台可用于筛选、构建和研究其它器官、组织的特异信号的相互作用网络。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要英文缩写
• 前言
• 第一章 JAK-STAT信号转导通路蛋白及其相互作用蛋白筛选成人肝cDNA文库
• 一、材料和方法
• 1 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 质粒
• 1.3 PCR引物
• 1.4 主要试剂
• 1.5 cDNA 文库
• 1.6 培养基及常用试剂
• 1.7 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 分子克隆
• 2.2 RT-PCR
• 2.3 人肝脏cDNA 文库质量控制及其扩增
• 2.4 Y2H筛选
• 二、结果
• 1 文库鉴定及其扩增
• 2 诱饵载体的构建
• 3 诱饵自激活检测
• 4 Y2H筛库
• 4.1 文库筛选及表型鉴定
• 4.2 Y2H筛库结果
• 5 筛库结果初步分析
• 三、讨论
• 第二章 相互作用数据的评价
• 一、材料和方法
• 1 酵母回转验证
• 2 生物信息学分析
• 二、结果
• 1 酵母回转验证
• 2 生物信息学分析
• 3 相互作用数据的整体评价
• 三、讨论
• 第三章 相互作用网络的构建及重要相互作用的发现
• 一、技术策略与方法
• 1 LCI数据的产生
• 2 网络的构建
• 3 重要相互作用的分析、发现
• 二、相互作用网络的构建
• 1 LCI相互作用网络
• 2 Y2H相互作用网络
• 3 整合LCI 和Y2H相互作用的网络
• 三、重要相互作用的分析、发现
• 1 潜在信号通路间的交联
• 2 重要蛋白的调节机制
• 3 从机制上证实蛋白新功能
• 4 揭示未知蛋白功能
• 5 揭示转录调控规律
• 四、讨论
• 总结
• 存在问题和展望
• 参考文献
• 附表
• 附录1 构建诱饵载体引物
• 附录2 诱饵蛋白结构域信息
• 附录3 猎物基因名和全名
• 附表1-1 酵母双杂交方法构建JAK-STAT信号转导通路相互作用网络所选诱饵基因
• 附表1-2 诱饵载体构建情况
• 附表1-3 自激活实验结果
• 附表1-4 诱饵筛库转化子数及其读框正确克隆的表型分布统计
• 附表1-5 Y2H筛库所得相互作用对
• 附表1-6 Y2H筛库结果－各选定基因筛到的相互作用
• 附表1-7 Y2H筛库结果－各选定基因筛到的相互作用对数
• 附表1-8 我们筛库结果同NATURE、CELL结果比较
• 附表2-1 回转验证实验结果
• 附表2-2 Y2H筛库所得共享3 级或以上GO-生物学过程或功能注释的相互作用对
• 附表2-3 大网络中含我们相互作用对的三环、四环的数量统计
• 附表2-4 诱饵猎物基因敲除表型相似或相同的筛库所得相互作用对
• 附表2-5 Y2H筛库所得各相互作用对经16 个标准评分后的得分总和
• 附表3-1 Y2H筛库所得相互作用网络中65 个已知与疾病有关的蛋白
• 在读期间发表或投稿的论文
• 个人简历
• 致谢