毛尖紫萼藓（Grimmia pilifera）cDNA文库构建及抗旱相关基因克隆与分析

论文摘要

干旱胁迫是影响植物生长发育的主要环境因素,严重影响农作物的产量。解决这个问题的有效途径是培育和利用优良的抗旱品种。应用比较功能基因组学方法筛选抗旱相关基因,并通过基因工程培育抗旱品种已成为植物遗传资源与品种改良研究的重要内容。毛尖紫萼藓（Grimmia pilifera）是典型旱生藓类,生长在向阳的裸岩上,具有很强的抗旱能力,是很好的抗旱基因资源。为研究毛尖紫萼藓响应干旱的分子机制,本研究采用SMART技术构建了毛尖紫萼藓干旱cDNA文库,文库滴度2.8×105pfu/mL,菌落PCR检测表明,插入片段分布在500-2000bp之间,平均大小约800bp,重组率约为91.7%。通过文库测序共获得1045条有效序列,其中高质量的996条,GenBank接收号为GR307103-GR308098。这些ESTs代表875个Unigenes,其中contig62个,singlet 813个。Blast N及Blast X分析表明,625个Unigenes与Nr数据库中已知基因序列具有相似性,250个Unigenes没有相似性。与已知序列具有相似性的Unigene依据GO注释分为16类,其中生理学进程占（21.17%）,细胞进程占（14.60%）,细胞占（13.63%）,催化占（13.14%）,结合占（10.71%）,细胞器占（10.46%）,蛋白复合体占（7.54%）,结构分子占（3.41%）,应激响应占（1.95%）,转运蛋白占（1.22%）,抗氧化剂占（0.97%）,翻译调节占（0.24%）,酶调节占（0.24%）,运动活性占（0.24%）,转录调节占（0.24%）,生物学途径调控占（0.24%）根据基因功能注释,共获得参与信号转导与基因表达调控、活性氧清除、光合系统保护及修复、蛋白质合成与降解、代谢、物质转运及离子平衡、细胞壁及细胞救援防御、抗胁迫8类68个抗旱相关基因。根据生物信息学分析结果,选择了9条毛尖紫萼藓抗旱相关的基因片段,采用荧光定量PCR进行干旱及复水条件下的表达分析。结果表明这些基因的表达都在一定程度上受干旱或复水的诱导,但不同基因的表达模式不同。通过Blast X分析,获得了毛尖紫萼藓抗坏血酸过氧化物酶、铜锌超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶及半胱氨酸过氧化物酶基因全长序列,命名为GpAPX、GpSOD、GpGST和GpCysPrx, GenBank接受号分别为GU989311、GU989312、GU989313和GU989314,通过生物信息学对其所编码的蛋白进行分析,同时利用荧光定量PCR技术分析干旱及复水条件下基因表达情况。本研究筛选获得部分抗旱相关基因,为植物抗旱基因工程研究提供了基因资源,同时也为毛尖紫萼藓抗旱分子机制研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 干旱胁迫诱导的基因表达
• 1.2.1 功能性蛋白
• 1.2.2 调节性蛋白
• 1.3 cDNA文库技术
• 1.3.1 cDNA文库的类型
• 1.3.2 cDNA文库的应用
• 1.3.3 cDNA文库技术在植物抗旱机制研究中的应用
• 1.4 EST技术及其应用
• 1.5 苔藓植物研究概述
• 1.5.1 苔藓植物分析生物学研究
• 1.5.2 苔藓植物抗旱性研究
• 1.6 本课题研究的目的意义
• 1.7 本项研究的内容和技术路线
• 2 毛尖紫萼藓干旱cDNA文库的构建
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 毛尖紫萼藓总RNA提取方法筛选
• 2.2.2 总RNA的纯化
• 2.2.3 cDNA文库的构建及滴度测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 RNA质量检测
• 2.3.2 cDNA第一链的LD-PCR
• 2.3.3 dsDNA的酶切及分级分离
• 2.3.4 cDNA文库的质量评价
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 毛尖紫萼藓干旱诱导基因表达谱分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 EST序列基本统计分析
• 3.2.2 EST序列同源性比对分析
• 3.2.3 同源序列的物种来源
• 3.2.4 基因功能分类
• 3.2.5 毛尖紫萼藓抗旱相关基因及分类
• 3.3 讨论
• 3.3.1 紫萼藓属EST资源
• 3.3.2 毛尖紫萼藓可能的抗旱机制
• 3.4 本章小结
• 4 抗旱相关基因表达分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 内参基因筛选
• 4.2.2 引物反应性分析
• 4.2.3 干旱及复水条件下基因表达研究
• 4.2.4 干旱及复水过程中基因表达研究
• 4.3 讨论
• 4.3.1 基因表达分析方法比较
• 4.3.2 抗旱相关基因表达分析
• 4.4 本章小结
• 5 全长cDNA序列的获得及生物信息学分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 全长基因生物信息学分析
• 5.2.2 干旱及复水条件下基因表达分析
• 5.3 讨论
• 5.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢