烟夜蛾性信息素结合蛋白2和谷胱甘肽S-转移酶基因的表达模式与原核表达

论文摘要

昆虫识别挥发性气味分子的灵敏性和特异性对其生存和繁殖起着重要作用,这个过程包括对气味分子的结合、接受、把化学信号转化为电信号的信号转导、信号终止等步骤,有多种蛋白相互作用共同完成。性信息素结合蛋白（pheromone binding proteins, PBPs）能选择性识别结构非常相似的性信息素成分,而谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases,GSTs）具有使醛类物质特别是性信息素信号终止的作用,因此,PBPs和GSTs在昆虫雌雄间信息交流中都具有重要的作用,并承担着不同的功能。本文对烟夜蛾Helicoverpa assulta PBPs和GSTs基因进行了克隆、表达模式及原核表达研究,期望为进一步分析和探明烟夜蛾雌雄间的信息交流机制提供依据。主要研究结果如下:（1）利用RT-PCR和RACE方法,从烟夜蛾雄虫触角中克隆了PBP2基因的开放阅读框及3′末端序列,该基因被命名为HassPBP2（GenBank登录号为EU316186）。克隆和测序结果表明,HassPBP2开放阅读框全长450bp,编码149个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为16.9kD,等电点为5.56。HassPBP2基因结构分析表明,该基因由3个外显子和2个内含子组成,内含子的长度分别为90bp和261bp。氨基酸序列联配分析表明,此序列具有气味结合蛋白的典型特征,与其他鳞翅目昆虫PBPs的一致性在34%-91%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera PBP2和烟芽夜蛾Heliothis virescens PBP2的序列一致性高达91%。（2）利用跨内含子引物和半定量RT-PCR方法,研究了HassPBP2在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况。结果表明,HassPBP2在卵期、幼虫期和蛹早期不表达,在蛹中期开始表达,并一直持续到成虫中后期,且只在雌雄成虫触角中表达。（3）成功构建了HassPBP2的原核表达载体pGEX-HassPBP2,导入大肠杆菌BL21（DE3）细胞中,经过IPTG诱导以及SDS-PAGE分析,结果表明融合蛋白得到了成功表达。（4）利用RT-PCR和RACE方法,从烟夜蛾雄虫触角中克隆了获得了1个谷胱甘肽S-转移酶基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为EU289223）。克隆和测序结果表明,该基因开放阅读框全长654bp,编码217个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为24.8KD,等电点为7.76。基因结构分析表明,该基因由6个外显子和5个内含子组成,内含子的长度分别为415bp、513bp、296bp、333bp和269bp。将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性和系统发育分析,发现该基因编码的蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员,将该基因命名为HaGSTe1。（5）利用跨内含子引物和半定量RT-PCR方法,研究了HaGSTe1在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况。结果表明,HaGSTe1在幼虫中期、晚期,蛹晚期和成虫期均表达,而在卵、幼虫早期和蛹早期、中期不表达;在雌、雄成虫的触角和喙中表达。并成功构建了HaGSTe1的原核表达载体pGEX-HassGSTe1。（6）利用RT-PCR方法,从烟夜蛾成虫腹部克隆获得了另1个谷胱甘肽S-转移酶基因的完整开放阅读框的cDNA序列（GenBank登录号:GQ856239）。该基因的开放阅读框全长636bp,编码211个氨基酸残基,推测编码蛋白的分子量为24.2kD,等电点为6.66。将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的GSTs进行同源性和系统发育分析,发现该基因编码的蛋白属于昆虫特异性Epsilon家族成员,将该基因命名为HaGSTe2。（7）利用半定量RT-PCR方法,研究了HaGSTe2在烟夜蛾不同发育期和组织内的表达情况。结果表明,HaGSTe2在雌、雄虫触角、喙、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅中均有表达,而且在卵、幼虫和蛹中也有表达。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 昆虫感知的气味化合物
• 1.1.1 植物挥发物
• 1.1.2 昆虫信息化学物质
• 1.2 昆虫触角的化学感器
• 1.3 昆虫嗅觉系统相关蛋白及其功能
• 1.3.1 气味结合蛋白
• 1.3.2 化学感受蛋白
• 1.3.3 气味受体蛋白
• 1.3.4 气味降解酶
• 1.3.5 神经元膜蛋白
• 1.4 昆虫嗅觉的中枢神经系统
• 1.5 昆虫性信息素结合蛋白的研究进展
• 1.5.1 昆虫性信息素结合蛋白的种类
• 1.5.2 昆虫性信息素结合蛋白的特性
• 1.5.3 昆虫性信息素结合蛋白与性信息素分子的结合及释放机制
• 1.5.4 昆虫性信息素结合蛋白的进化基因组学
• 1.5.5 昆虫性信息素结合蛋白的功能
• 1.5.5.1 生理功能
• 1.5.5.2 化电转能作用
• 1.6 昆虫气味降解酶研究进展
• 1.6.1 酯酶
• 1.6.2 醛氧化酶
• 1.6.3 环氧化物水解酶
• 1.6.4 细胞色素P450
• 1.6.5 谷胱甘肽S-转移酶
• 1.6.5.1 谷胱甘肽-S 转移酶的分类与命名
• 1.6.5.2 谷胱甘肽-S 转移酶的结构
• 1.6.5.3 谷胱甘肽-S 转移酶的功能
• 1.6.5.4 谷胱甘肽-S 转移酶基因的结构
• 1.6.5.5 谷胱甘肽-S 转移酶基因的表达调控
• 1.6.5.6 昆虫触角谷胱甘肽-S 转移酶研究概况
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 供试材料
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 菌种及质粒
• 3.1.3 主要试剂及工具酶
• 3.1.4 试剂盒
• 3.1.5 缓冲溶液
• 3.1.6 培养基
• 3.1.7 SDS-PAGE 主要试剂
• 3.1.8 其他溶液
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 烟夜蛾PBP2 基因的克隆、表达模式分析与原核表达
• 3.2.1.1 不同组织总RNA 提取
• 3.2.1.2 反转录
• 3.2.1.3 烟夜蛾基因组DNA 的提取
• 3.2.1.4 引物设计与合成
• 3.2.1.5 烟夜蛾PBP2 基因cDNA 片段的扩增（内部扩增）
• 3.2.1.6 烟夜蛾PBP2 基因cDNA 3'末端的扩增（3'RACE）
• 3.2.1.7 烟夜蛾PBP2 基因开放阅读框架（ORF）的扩增
• 3.2.1.8 烟夜蛾PBP2 基因内含子序列的扩增
• 3.2.1.9 烟夜蛾PBP2 基因在不同组织和发育期的表达
• 3.2.1.10 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.1.11 PCR 产物纯化
• 3.2.1.12 克隆载体与PCR 纯化产物的连接
• 2 法）'>3.2.1.13 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 3.2.1.14 连接载体的转化
• 3.2.1.15 阳性克隆的筛选
• 3.2.1.16 序列测定与分析
• 3.2.1.17 质粒DNA 的提取
• 3.2.1.18 烟夜蛾PBP2 基因原核表达载体的构建
• 3.2.1.19 烟夜蛾PBP2 基因重组表达载体的转化与鉴定
• 3.2.1.20 烟夜蛾PBP2 融合蛋白的原核表达
• 3.2.1.21 烟夜蛾PBP2 基因原核表达产物的SDS-PAGE 检测
• 3.2.2 烟夜蛾GSTe1 基因的克隆、表达模式分析与原核表达
• 3.2.2.1 不同组织总RNA 提取、反转录、基因组DNA 的提取
• 3.2.2.2 引物设计与合成
• 3.2.2.3 烟夜蛾GSTe1 基因ORF 的扩增
• 3.2.2.4 烟夜蛾GSTe1 基因相关试验的其他方法
• 3.2.3 烟夜蛾GSTe2 基因的克隆与表达模式分析
• 3.2.3.1 不同组织总RNA 提取和反转录
• 3.2.3.2 引物设计与合成
• 3.2.3.3 烟夜蛾GSTe2 基因ORF 的扩增
• 3.2.3.4 烟夜蛾GSTe2 基因相关试验的其他方法
• 4 结果与分析
• 4.1 烟夜蛾PBP2 基因的克隆、表达模式分析与原核表达
• 4.1.1 烟夜蛾PBP2 基因cDNA 和内含子的扩增、克隆及序列测定
• 4.1.2 烟夜蛾PBP2 基因cDNA 的序列分析
• 4.1.3 烟夜蛾PBP2 基因编码区结构分析
• 4.1.4 烟夜蛾PBP2 基因的表达模式分析
• 4.1.5 烟夜蛾PBP2 基因原核表达载体的构建与表达
• 4.2 烟夜蛾GSTE1 基因的克隆、表达模式分析与原核表达
• 4.2.1 烟夜蛾GSTE1 基因cDNA 和内含子的扩增、克隆及序列测定
• 4.2.2 烟夜蛾GSTE1 基因cDNA 的序列分析
• 4.2.3 烟夜蛾GSTE1 基因结构分析
• 4.2.4 烟夜蛾GSTE1 基因的表达模式分析
• 4.2.5 烟夜蛾GSTE1 基因原核表达载体的构建与表达
• 4.3 烟夜蛾GSTE2 基因的克隆与表达模式分析
• 4.3.1 烟夜蛾GSTE2 基因cDNA 的扩增、克隆及序列测定
• 4.3.2 烟夜蛾GSTE2 基因cDNA 的序列分析
• 4.3.3 烟夜蛾GSTE2 基因的表达模式分析
• 5 结论与讨论
• 5.1 烟夜蛾 PBP2 基因序列
• 5.2 烟夜蛾 PBP2 基因的表达模式
• 5.3 烟夜蛾 PBP2 与 GSTE1 基因的结构
• 5.4 烟夜蛾 GSTE1 基因序列及其表达模式
• 5.5 烟夜蛾 GSTE2 基因序列及其表达模式
• 5.6 烟夜蛾PBP2 和GSTE1 基因的原核表达研究
• 参考文献
• ABSTRACT