论文摘要
月腺大戟醋制减毒机理研究是国家中医药管理局公益性行业专项基金项目——中药麸制及有毒中药炮制技术与原理研究（NO.200807039）资助项目,是江苏省优势学科建设工程中药学一级学科开放课题（2011ZYX2-011）资助项目。有毒中药饮片炮制规范化和质量标准化是保证其临床应用安全、有效的关键,而炮制机理研究是评判炮制工艺和质量标准的基础。所以,有毒中药炮制机理研究,对其确保临床应用的安全有效具有十分重要的意义。中药狼毒是卫生部公布的28种国家医疗用毒性药品管理品种之一,是2010年版《中国药典》重新收录品种,主要来源为大戟科植物月腺大戟和狼毒大戟。具有逐水祛瘀,散结杀虫的功效。本品性峻猛,有毒。毒性反应为口腔、咽喉部灼热刺激感并充血,呕吐,腹痛,腹泻,泻出血便,甚至出现痉挛,狂躁等。因此,常炮制后入药,代表性炮制方法为“醋制法”。前期研究中,我们以月腺大戟作为研究对象,对其毒性、炮制工艺及质量标准进行了初步研究。研究发现其毒性主要表现为强烈的刺激性、生殖毒性,经醋制后,毒性明显减弱。在研究过程中,我们同时发现存在以下问题：一,月腺大戟缺乏商品对照品,且刺激性成分不明确,给后续研究带来困难。二,月腺大戟炮制机理不明确,质量控制方面研究不足,使质量标准无法完善,无法指导临床安全用药。因此,对月腺大戟刺激性成分及炮制减毒机理的研究就尤为迫切。针对上述问题,本课题对月腺大戟产生刺激性的部位及刺激性部位的化学成分进行了研究,并通过醋制前后指纹图谱变化研究,炮制过程中化学成分含量变化研究,多元统计方法快速全面找寻醋制前后差异性较大的特征标记物等几个方面,为醋制减毒机理研究提供科学依据。主要研究内容如下：一文献研究对狼毒进行了本草考证,对其炮制方法进行了总结。对作为其主要来源之一的月腺大戟进行了化学成分、药理作用、临床应用及毒性反应等方面的研究。为月腺大戟的进一步研究奠定理论基础。二月腺大戟刺激性部位的研究采用小鼠胃肠道刺激性实验,以小鼠胃体PGE2含量及胃体相对重量为指标,对月腺大戟的提取方法及刺激性部位进行了考察。确定刺激性成分提取较完全的方法为95%乙醇加热回流提取1 h,刺激性部位为石油醚部位,醋制后刺激性大大降低。对刺激性部位的化学成分进行了分离、纯化及鉴定。得到6种化合物,为jolkinolide B、β-amyrinacetate、2,4-dihydroxy-6-methoxy-3-methy-l-acetophenone、 24-methylenecycoartanol、ebractedatanolide A、β-sitosterol,这些成分多为萜类成分,且已有研究证明jolkinolide B作为一种二萜内酯类物质,具有刺激性毒性和生殖毒性。因此,jolkinolide B作为一种刺激性成分,与炮制机理密切相关,应进一步研究。此实验验证了月腺大戟醋制后刺激性减弱,并为月腺大戟的进一步研究提供了对照品。三月腺大戟醋制前后指纹图谱的研究研究表明,月腺大戟醋制后刺激性降低,为反映炮制前后化学成分的整体变化,建立月腺大戟生醋品指纹图谱。收集10批次月腺大戟生品及醋制品,初步建立了月腺大戟生、醋品的HPLC指纹图谱,以反映生醋品的整体化学特征。以月腺大戟乙素峰作为对照峰,确定月腺大戟生品中有20个共有峰,醋制品中有24个共有峰。醋制前后多数峰峰面积发生变化,而鲜有新峰明显出现或色谱峰消失。说明经醋制后,月腺大戟整体化学特征发生变化,这种改变以量变为主。指纹图谱可以用于月腺大戟生醋品饮片的质量控制,而醋制前后指纹图谱的改变与炮制机理相关。四炮制过程中化学成分的变化研究研究表明,经醋制后,月腺大戟整体化学特征发生变化,这种改变以量变为主。因此我们进一步研究炮制过程中月腺大戟成分含量的变化,建立不同炮制品的特征图谱。采用不同辅料和温度制备炮制品,测定不同炮制品中有效成分狼毒乙素、狼毒丙素及刺激性成分岩大戟内酯B（jolkinolide B）含量,同时建立各自特征指纹图谱,比较其相似度。结果发现有效成分狼毒乙素、狼毒丙素的含量随着温度的升高基本呈现先上升后下降的趋势,刺激性成分岩大戟内酯B的含量随温度的升高呈现不断降低的趋势。醋制烘干品较其他炮制品更能发挥减毒保效的炮制作用,辅料醋不能被化学试剂乙酸替代。用醋闷润和加热都能使刺激性成分岩大戟内酯B含量显著降低。不同炮制品的HPLC图谱差别较大,相似度低。通过本研究我们发现辅料和温度对月腺大戟化学成分的影响较大。在醋制过程中刺激性成分岩大戟内酯B含量的显著降低,可能是造成醋制后刺激性降低的个重要原因,是对醋制减毒机理的重要说明。五超高效液相-飞行时间质谱联用多元数学统计法分析月腺大戟醋制前后特征标记物为快速全面找寻炮制前后发生明显变化的标记性化学成分（特征标记物）,我们运用超高效液相色谱-质谱联用技术采集数据,将waters公司masslynx工作站下Makerlynx软件采集的数据,进一步进行主成分分析研究,同时将数据运用SIMICA-P软件进行正交偏最小二乘（OPLS-DA）分析,以得到生品和炮制品中主要差异成分即特征标记物的信息。对这些特征标记物进行定性分析,得到标记物17-hydroxy-jolkinolide A、JolkinolideB、Ebracteolatinolide A、enti-11b-hydroxyabieta-8（14）,-13（15）-dien-16-12b-olide等。经分析这些化合物都属于二萜内酯类化合物。因此,我们推测JolkinolideB等二萜内酯类化合物与其炮制减毒机理密切相关,应进一步有针对性的研究,并将这些化合物用于生品及炮制品的质量控制。