shRNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc145细胞中复制的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）属于尼多病毒目动脉炎病毒科，它主要引起母猪早产、流产等繁殖障碍，仔猪、育肥猪呼吸困难及育成猪类流感疾病，此外该病毒持续性感染，可引起免疫抑制，成为危害世界养猪业安全的重要病原之一。然而，目前疫苗的使用只能够提供部分保护使机体不再出现临床症状，不能够阻止感染，因此，迫切需要开发一种新型的、能对所有PRRSV病毒株提供保护的抗病毒措施。 RNA干扰是由双链RNA（dsRNA）引发的信使RNA（mRNA）序列特异性消减现象，是一种保守的抗病毒机制，已发现于线虫、植物和哺乳动物中。将21～23nt的小分子干扰RNA双链（small interference RNA，siRNA）或载体DNA转录的发夹RNA（short hairpin RNAs，shRNAs）导入细胞，可以抑制同源的内源或病原mRNA的表达。近几年，RNAi技术已被用于干扰HBV、HCV、流感和其他人类病毒的感染研究，提示RNAi作为一个有效的抗病毒策略，具有很大应用前景，但是目前对于PRRSV是否存在RNA干扰现象，究竟哪些基因哪些序列是合适的靶标，shRNA对PRRSV抑制有哪些特征等等，尚没有这方面的研究。 为了探讨pSUPER质粒能否有效表达发夹小干扰RNA（shRNA），作为RNAi研究的平台，本研究利用RNA干扰技术，以A型流感病毒核衣壳蛋白（NP）基因为靶基因，选用已知的有高效抑制效果的siRNA片段，设计有小发夹结构的两条寡核苷酸序列，经退火成互补双链，再克隆至质粒pSUPER中，经酶切鉴定和测序证实表达质粒构建成功，命名为pSUPER-NP。将该表达质粒转染鸡胚成纤维细胞（CEF），24h后用A型流感病毒感染，病毒感染40h后观察细胞病变，测定病毒血凝效价和TCID50，发现pSUPER-NP能够阻止细胞病变的出现，pSUPER-NP转染孔的血凝价和TCID50均显著下降，表明该表达质粒能抑制流感病毒的复制，pSUPER质粒可以应用于哺乳动物高效的RNAi研究，也为探索流感病毒致病机理和开发基因治疗新途径奠定了基础。 RNAi抑制效果的正确评价，需要合适的检测方法，为了建立灵敏、快速的mRNA检测方法，本研究设计合成了一套引物和TaqMan探针，以扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒的核衣壳蛋白基因，通过反应条件的优化，建立了快速定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时PCR方法，并用该法检测患病猪的肺脏等样品。结果表明该方法具有较好的特异性和重复性，对PRRSV细胞培养物的检测下限为0.01TCID50，敏感性比常

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展
• 1 PRRSV基因组成及结构蛋白
• 2 PRRSV的组织嗜性与受体
• 3 PRRSV病毒复制与蛋白功能
• 4 预防PRRSV感染的疫苗研究
• 参考文献
• 第二章 siRNA干扰病毒复制研究进展
• 1 siRNA靶序列的选择
• 2 siRNA的获得和导入途径
• 3 siRNA的应用
• 4 RNA干扰的局限性
• 5 结语
• 参考文献
• 第三章 pSUPER质粒作为RNA干扰研究平台的可行性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2 重组质粒的序列测定
• 2.3 RNA干扰效果的检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第四章 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 实时PCR反应体系的优化
• 2.2 实时PCR重复性实验
• 2.3 实时PCR特异性实验
• 2.4 实时PCR敏感性实验
• 2.5 实时PCR与常规PCR敏感性比较
• 2.6 实时PCR对PRRS疑似猪组织样品的检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第五章 质粒转染Marc145细胞条件的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 脂质体与质粒比例
• 2.2 转染试剂的选择
• 2.3 最佳转染剂量
• 2.4 细胞密度
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第六章 PRRSV不同ORFs基因和5'UTR序列shRNA表达质粒的构建与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 shRNA的设计
• 2.2 shRNA表达载体的构建与鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第七章 PRRSV不同ORFs基因和5'UTR序列shRNA对靶基因转录和表达的特异性抑制
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增目的基因片段
• 3.2 重组质粒酶切鉴定
• 3.3 ORFs-EGFP和UTR-EGFP于HEK293A细胞融合表达鉴定
• 3.4 shRNA表达质粒对靶基因在蛋白质水平上的特异性抑制
• 3.5 shRNA表达质粒对靶基因在mRNA水平上的特异性抑制
• 4 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第八章 PRRSV ORF5和ORF7编码区shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 shRNA表达质粒抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制
• 2.2 shRNA表达质粒对PRRSV复制的抑制作用有剂量依赖性
• 2.3 shRNA表达质粒抑制PRRSV复制的序列特异性
• 2.4 shRNA表达质粒抑制PRRSV复制具有作用相加性
• 2.5 shRNA表达质粒能持续性的抑制PRRSV复制
• 2.6 先感染PRRSV再转染shRNA表达质粒抑制作用依然存在
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 第九章 PRRSV ORF1b、ORF6编码区和5UTR shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的观察
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 间接免疫荧光实验
• 2.2 病毒滴度测定
• 2.3 实时PCR对病毒mRNA水平的检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 全文总结
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文