论文摘要
目的:本研究从细胞分子水平研究中药香加皮两种提取物的抗肿瘤和免疫调节作用以及它们的作用机制,以其为治疗食管癌寻找有效药物,同时为中药香加皮的二次开发利用提供实验依据。方法: 1.采用MTT法分析不同浓度香加皮杠柳苷（CPP）作用不同时间后,对四种恶性程度不同的食管癌细胞株TE-13、Eca-109、TE-1、TE-10增殖反应的影响。2.用不同浓度CPP分别处理TE-13细胞48h后,采用Gimsa染色技术和流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期分布情况。3.采用Western blot技术分析细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2和CDK4的表达变化,以探讨CPP诱导细胞凋亡及细胞生长周期阻滞的可能机制。4.采用RT-PCR法分析四种食管癌细胞株TE-13、Eca- 109、TE-1和TE-10 syk mRNA的表达状态,以及经CPP处理后syk mRNA表达的改变,同时采用流式细胞技术分析CPP处理细胞后细胞syk蛋白表达的变化。5.无菌分离健康人外周血淋巴细胞,MTT法分析不同浓度香加皮羽扇豆烷乙酸酯（CPLA）对人外周血淋巴细胞增殖和对巨噬细胞吞噬功能的影响。6.用ELISA和RT-PCR法分析CPLA对人外周血淋巴细胞产生细胞因子功能的影响。结果:1.香加皮提取物杠柳苷（CPP）体外对恶性程度不同的食管癌细胞TE-13、Eca-109、TE-1、TE-10的增殖反应均有显著抑制作用（P<0.01）,并呈时间和浓度依赖性,药物浓度越大,作用时间越长,抑制效应越强。10μg/ml的CPP处理72h时,对食管癌细胞TE-13、Eca-109、TE-1的抑瘤率分别达到（84.03±0.97）%、（80.56±0.65）和（72.49±2.1）%,而对TE-10的增殖抑制作用较对TE-13、Eca-109、TE-1细胞的抑制作用为低,72h的抑制率为（32.06±1.56）%。2. CPP作用于肿瘤细胞后,可诱导典型的细胞凋亡形态变化,如细胞胞体缩小、胞质浓缩、胞核向外呈锐角突起、染色质高度浓缩、核仁边集于核膜下或呈新月形,有的细胞出现核固缩、核碎裂以及凋亡小体等典型细胞凋亡的形态特征。流式细胞分析结果也显示,CPP能使TE-13细胞发生凋亡和生长周期阻滞,处理48h时,凋亡率明显增加,且呈浓度依赖性;G0/G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少,与对照组相比,差异有显著性（P<0.01）。3. CPP能够使TE-13细胞CDK4蛋白表达水平明显下调,1-5μg/mlCPP均可明显下调减少TE-13细胞CDK4的表达,与对照组相比,差异有显著性（P<0.01）。CPP对CDK2的蛋白表达没有明显影响。4. RT-PCR法分析结果显示高度恶性的细胞株TE-13、Eca-109 syk mRNA（514bp）表达弱阳性,恶性程度比较低的食管癌细胞株TE-1syk mRNA表达水平明显高于TE-13、Eca-109细胞,而在恶性程度比较低的食管癌细胞株TE-10中却未检测到syk mRNA的表达。经CPP处理后,TE-13、Eca-109、TE-1 syk mRNA表达增强（P<0.01）;CPP对TE-10细胞sykmRNA表达没有影响（P>0.05）。流式细胞技术显示上述细胞syk蛋白表达水平结果与mRNA表达情况相符合。5.香加皮提取物羽扇豆烷乙酸酯（CPLA）能明显促进PHA活化的人外周血淋巴细胞的增殖以及吞噬细胞的吞噬作用,经20μg/ml的CPLA处理72小时后,淋巴细胞的增殖指数达到1.26,与对照组相比,明显增高（P<0.01）;5-40μg/ml的CPLA均能明显增强吞噬细胞对肿瘤细胞的杀伤率, 40μg/ml的CPLA处理吞噬细胞后,能使其对食管癌细胞TE-13的杀伤率达到54.00%。6. ELISA检测结果显示,经CPLA作用后,人外周血淋巴细胞产生TNF-α和IL-2水平显著升高（P<0.01）,且具有明显的量效关系。RT-PCR分析结果显示,20μg/ml和40μg/ml CPLA处理后,能明显增强PHA的活化作用,使淋巴细胞IFN-γmRNA的表达水平明显增强（P<0.01）。结论:1.香加皮提取物杠柳苷（CPP）体外能明显抑制食管癌细胞的增殖。2. CPP对食管癌细胞TE-13的抑制作用可能与其诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞有关,CPP能使TE-13细胞的生长周期阻滞在G0/G1期,其机制可能与CPP下调细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4的表达有关。3. CPP的抑瘤作用可能还与其恢复候选抑癌基因syk mRNA和蛋白的表达有关,表明CPP发挥抑瘤作用是多基因、多靶点的。4.香加皮羽扇豆烷乙酸酯（CPLA）成份能增强人外周血淋巴细胞的免疫功能,能促进PHA活化的淋巴细胞增殖;5. CPLA能增强吞噬细胞对肿瘤细胞的杀伤功能,其机制可能与CPLA能促进吞噬细胞产生TNF-α有关。6. CPLA能促进外周血淋巴细胞产生TNF-α和IL-2等细胞因子,并能增强外周血淋巴细胞IFN-γmRNA的表达。
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