猪支原体肺炎诊断方法及其病原P46基因原核表达的研究

论文摘要

猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine , MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae , Mhp ）引起的猪的一种高发病率,低死亡率的慢性呼吸道传染病,在我国常被称为猪气喘病（或喘气病）。MPS广泛分布于世界各地,猪群中Mhp的感染率在30%～80%,目前大多数养猪国家均报道有此病的发生。病猪长期生长发育不良,生长率和饲料转化率降低,一般死亡率不高,但继发性感染也会造成严重死亡,所致的经济损失很大,对养猪业发展带来严重危害,所以该病是最常发生和经济意义重大的猪病之一。因此,建立可靠实用的MPS快速诊断技术,以便控制和预防该病已成为目前猪病防治的重要研究内容。本试验调查了陕西省宝鸡、杨凌地区自然感染猪支原体肺炎的病例,根据流行病学调查和症状观察表明,MPS不同年龄、性别和品种的猪均能感染,但其中哺乳仔猪及幼龄猪发病率及病死率最高;临床症状可表现为急性、慢性或隐性经过。通过病理剖检和组织学观察表明,MPS病理变化的主要特征是融合性支气管肺炎,于肺脏的不同部位呈“肉样”或“虾肉样”实变;组织学变化以细支气管腔和肺泡腔内细胞浸润为特征;另外肝、脾、肾等器官也发生不同程度的肿大及组织细胞的浸润。参照已发表的猪肺炎支原体P46基因序列,设计合成了1对引物,用此引物进行PCR扩增,得到与预期相符的目的片段。目的片段的序列比较结果表明分离菌株与参考菌株同源性为98.5%。结果表明,此试验中建立的PCR检测方法是成功的。用该方法同时扩增肺炎双球菌、羊链球菌、结核分支杆菌,除猪肺炎支原体扩增出一特异的条带外,其余的均无条带产生,证明了该PCR检测方法具有很强的特异性。对于PCR的敏感性试验显示这对引物能够检测到1ng的DNA,说明具有较强的灵敏度。PCR扩增采集的病料检测结果与临床诊断和病理学诊断结果完全一致。将Mhp的P46基因克隆于pET-32α原核表达载体T7启动子的下游,构建了pET-P46原核表达载体。该载体在其宿主菌BL21（DE3）中诱导表达大小约为47ku的蛋白质,其大小与预计的蛋白大小一致,且随着IPTG诱导时间的变化蛋白含量明显增多,初步表明P46基因获得表达,为进一步建立特异和敏感的ELISA诊断方法奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 第一章 猪支原体肺炎研究进展
• 1.1 MPS病原学研究
• 1.1.1 病原基本特性
• 1.1.2 猪支原体肺炎的血清抗体变化
• 1.1.3 猪肺炎支原体的致病机理
• 1.1.4 猪肺炎支原体的黏附因子
• 1.1.5 与猪肺炎支原体致病相关的几种细胞因子
• 1.1.6 猪肺炎支原体的主要抗原
• 1.2 猪支原体肺炎流行病学
• 1.2.1 易感动物
• 1.2.2 传染源及传播途径
• 1.2.3 流行特点
• 1.3 猪支原体肺炎临床特征
• 1.3.1 急性型
• 1.3.2 慢性型
• 1.3.3 隐性型
• 1.4 猪支原体肺炎病理变化
• 1.5 猪支原体肺炎的诊断
• 1.5.1 猪支原体肺炎的病原检测技术
• 1.5.2 抗体检测技术
• 1.6 猪支原体肺炎的防控措施
• 1.6.1 环境控制与药物治疗
• 1.6.2 免疫预防
• 试验研究
• 第二章 猪肺炎支原体自然感染病例的调查及病理组织学观察
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 流行病学调查
• 2.2.2 典型病例的临诊诊断和病理学诊断
• 2.3 结果
• 2.3.1 流行病学调查结果
• 2.3.2 临床表现
• 2.3.3 病理剖检变化
• 2.3.4 病理组织学变化
• 2.4 讨论
• 第三章 猪肺炎支原体PCR 检测方法的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株及病料
• 3.1.2 主要试剂与仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物设计与合成
• 3.2.2 核酸的提取及PCR 扩增
• 3.2.3 PCR 扩增产物的鉴定及序列分析
• 3.2.4 PCR 敏感性试验
• 3.2.5 PCR 特异性试验
• 3.2.6 病料检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 PCR 扩增产物的鉴定
• 3.3.2 PCR 产物的核苷酸序列分析
• 3.3.3 PCR 方法的敏感性鉴定
• 3.3.4 PCR 方法的特异性鉴定
• 3.3.5 采集病料的部分检测结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 PCR 检测方法特异性强、灵敏度高
• 3.4.2 PCR 检测方法的速度快
• 3.4.3 建立的PCR 方法与其他诊断方法的比较
• 第四章 猪肺炎支原体P46 基因在大肠杆菌中的表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 PCR 扩增结果
• 4.2.2 克隆载体pMD-18T-p46 的鉴定
• 4.2.3 原核表达载体pET-p46 的鉴定PCR 方法的敏感性鉴定
• 4.2.4 测序结果同源性比较
• 4.2.5 p46 蛋白的诱导表达和 SDS-PAGE 分析
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介