论文摘要
原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC）是一种慢性进行性胆汁淤积性自身免疫性肝病,以肝内中、小胆管损伤为主,其病因和发病机制尚不明确。其血清学特征主要是抗线粒体抗体（AMA）,尤其是抗M2亚型抗体阳性,阳性率可达95%以上。M2有多个抗原,其中最主要的是丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基（PDC—E2）,其次是2-氧戊二酸脱氢酶复合体（OGDC）和支链2-氧酸脱氢酶复合体（BCOADC）的E2亚基。由于PDC-E2与PBC的特殊关系,人们对其进行了深入的研究,结果发现在PBC患者BECs表面表达PDC-E2,那么PDC-E2对BECs有何作用?尚待研究。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是病原微生物各种成分的模式识别受体（Pattern recognition receptor,PRR）,在联系固有免疫和获得性免疫中起到重要的桥梁作用。TLR4是Medzhitov等于1997年发现和鉴定的第一个人类TLR,其天然配体是革兰阴性细菌细胞壁成分——脂多糖（LPS）。此外,尚存在多种内源性物质,如热休克蛋白（HSP）60、HSP22、透明质酸、HMGB、中性粒细胞弹性蛋白酶、髓系相关蛋白（Mrp）8和Mrp14等都可以活化TLR4信号转导通路,参与多种自身免疫性疾病的发生。近来研究表明,PBC患者肝内胆管上皮细胞（intrahepatic biliary epithelial cells,IBECs）TLR4表达明显上调;体外培养的PBC患者外周血单核细胞对LPS的反应性明显增高;LPS可以通过活化NF—κB和MAPX途径刺激BEGs分泌炎症因子或趋化因子IL-6、MCP-1及IL-8。上述研究提示:一、人BECs有TLR4表达;二、TLR4参与的天然免疫在PBC发病中具有一定作用。但很多PBC患者包括本研究所选病例并未检测到病原体或LPS,那么是什么原因使TLR4表达增高呢?是否存在其它内源性成分可以被TLR4识别,从而上调TLR4表达,刺激TLR4通路活化?尚无文献报道。基于以上研究现状,我们提出了这样一个假设:表达于HIBEC的线粒体M2蛋白可以通过活化TLR4信号转导通路促进HIBEC表达ICAM-Ⅰ等黏附分子,分泌MCP-1、IL-8、MIP-1α等趋化因子,招募单核/巨噬细胞等各种炎症细胞或免疫细胞,M2蛋白还可以通过TLR4信号转导通路活化单核/巨噬细胞,促进其分泌TNF-α、IL-12、sTRAIL等炎症因子和细胞因子,从而引起HIBEC的损伤,导致PBC的发病。为证实这一假设,我们进行了下面的研究:一、检测PBC患者外周血白细胞TLR4的表达,从临床水平探讨TLR4与PBC的关系;二、从细胞水平探讨M2蛋白通过TLR4信号转导通路对HIBEC的作用;三、探讨M2蛋白对单核细胞的作用及其与TLR4信号转导通路的关系。第一部分Toll样受体4在原发性胆汁性肝硬化患者外周血白细胞的表达及临床意义研究在本部分研究中,我们主要检测了TLR4在PBC患者外周血白细胞中的表达,并以乙肝后肝硬化和健康人群为对照,探讨了外周血白细胞TLR4的表达改变与PBC发病的关系。30例PBC患者,20例疾病对照及30名健康个体外周血白细胞TLR4基因和蛋白的检测分别应用实时荧光定量RT-PCR和流式细胞术（FCM）的方法;血清细胞因子的检测采用ELISA方法;GGT和ALP通过全自动生化分析仪测定结果。结果显示,PBC患者和乙肝后肝硬化患者外周血单核细胞TLR4蛋白的阳性表达率及PBMCs的TLR4 mRNA表达量均显著高于健康对照组（P＜0.05）,各组人群外周血单核细胞TLR4蛋白阳性表达率均与外周血PBMCs中TLR4 mRNA表达水平成显著相关性。PBC患者和乙肝后肝硬化患者血清细胞因子TNF-α和IL-12浓度均显著高于健康对照。PBC患者血清ALP和GGT浓度显著高于乙肝后肝硬化患者和健康对照。PBC患者外周血白细胞TLR4基因和蛋白的表达水平与TNF-α及IL-12均呈显著相关性,而与血清ALP和GGT无明显的相关性。这些结果提示,TLR4及其信号通路的异常与PBC的发病密切相关。第二部分线粒体M2蛋白通过TLR4通路对人肝内胆管上皮细胞的作用为探讨人肝内胆管上皮细胞（HIBEC）表面线粒体M2蛋白对HIBEC的作用及其与TLR4的关系,我们在本部分研究中体外培养了HIBEC。首先,应用FCM分析不同浓度线粒体M2蛋白对HIBEC表面TLR4表达的影响;然后,分别以FCM、ELISA、Western blot及EMSA技术分析了siRNA封闭TLR4信号通路前后,M2蛋白对HIBEC的作用,包括:凋亡情况、黏附分子ICAM-Ⅰ的表达、趋化因子MCP-1、IL-8及MIP-1α的分泌、细胞内IκB和pJNK含量及NF-κB活性,并以张氏肝细胞作为对照。结果显示:1)HIBEC和张氏肝细胞均有TLR4的表达,HIBEC细胞TLR4的阳性表达率为[（70.3±2.3）%]明显高于张氏肝细胞[（9.6±0.4）%]。2μg/ml线粒体M2蛋白刺激24小时即可使HIBEC和张氏肝细胞TLR4的阳性表达率明显增加（P＜0.05）,且呈浓度依赖性。2)不同浓度M2蛋白刺激HIBEC 24h,早期凋亡均有明显增加,但无浓度依赖性;siRNA封闭TLR4后,2μg/mlM2组早期凋亡无明显变化;而10μg/ml和50μg/mlM2组,HIBEC早期凋亡显著增加,尤以浓度为10μg/mlM2组增加更为明显。与HIBEC不同,各种浓度刺激张氏肝细胞24h,细胞早期凋亡均无显著增加,甚至有下降的趋势。siRNA沉默TLR4基因后,各种浓度M2蛋白刺激均会使张氏肝细胞早期凋亡显著增加,尤以10μg/ml和50μg/ml的M2组更为明显。3)浓度为2μg/ml的线粒体M2蛋白刺激24h后,HIBEC表面ICAM-Ⅰ的阳性表达率即显著高于空白对照;当M2蛋白浓度增加到10μg/ml和50μg/ml时,ICAM-Ⅰ的阳性表达率有下降趋势,但仍显著高于空白对照。siRNA沉默TLR4基因后,ICAM-Ⅰ的阳性表达率均显著降低。与HIBEC不同,在无任何刺激的情况下,张氏肝细胞表面ICAM-Ⅰ的阳性表达率明显高于HIBEC;浓度为2μg/ml和10μg/ml的M2蛋白刺激24h时,张氏肝细胞表面ICAM-Ⅰ的阳性表达率较空白对照无明显增加,当M2蛋白浓度为50μg/ml时,张氏肝细胞表面ICAM-Ⅰ的阳性表达率才显著增加;有趣的是,siRNA沉默TLR4基因后,ICAM-Ⅰ的阳性表达率显著增高。4)M2蛋白刺激前后,HIBEC和张氏肝细胞均不分泌趋化因子MIP-1α,张氏肝细胞亦几乎不分泌趋化因子MCP-1,二者均分泌趋化因子IL-8,浓度为2μg/ml M2刺激HIBEC 24h,细胞分泌IL-8基本不受影响,M2浓度为10μg/ml时,分泌IL-8明显增高,且呈浓度依赖。siRNA封闭TLR4基因后,HIBEC分泌IL-8明显下调。各种浓度M2蛋白刺激24h,对张氏肝细胞分泌IL-8的影响并不明显,甚至高浓度的M2（50μg/ml）蛋白有抑制张氏肝细胞分泌IL-8的趋势。M2蛋白刺激HIBEC 24h,细胞分泌MCP-1亦明显增加,且有浓度依赖性,siRNA封闭TLR4基因后,MCP-1明显下调。5)浓度为50μg/ml的线粒体M2蛋白刺激HIBEC和张氏肝细胞,细胞内均未检测到pJNK;HIBEC细胞内IκB-α含量明显减少,SiRNA使TLR4基因沉默后,IκB-α含量又明显增加,而张氏肝细胞内IκB-α含量无明显变化。6)PDTC封闭NF-κB与siRNA封闭TLR4结果相似。本部分研究结果表明,M2蛋白可以上调HIBEC表面TLR4的表达,并通过活化TLR4信号转导通路并以NF-κB依赖途径促进HIBEC表达黏附分子,分泌趋化因子,招募各种免疫细胞,损伤HIBEC,引起PBC发病。但M2蛋白本身对HIBEC的凋亡作用却受TLR4信号转导通路的抑制,其具体机制尚待进一步研究。第三部分线粒体M2蛋白通过TLR4通路对单核细胞的作用研究表明,PBC患者肝门管区有大量的炎性细胞浸润,包括淋巴细胞、单核细胞等。已经证明,自身反应性T淋巴细胞可以识别PDC-E2的某几段表位,如PDC-E2159-167和PDC-E2163-176,B淋巴细胞产生的IgA抗体亦可识别PDC-E2。但关于单核细胞的作用以及单核细胞与线粒体M2蛋白的关系尚未明确。因此,我们在这部分研究中以U937细胞作为单核细胞模型,探讨了线粒体M2蛋白对单核细胞的影响及TLR4信号转导通路在其中所起的作用。首先,我们应用FCM分析了线粒体M2蛋白对U937细胞表面TLR4表达的调节作用;然后,我们分别应用ELISA、Westernblot及EMSA技术分析了siRNA封闭TLR4基因前后,M2蛋白对单核细胞的作用,包括:对TNF-α、IL-12、sTRAIL等细胞因子的分泌、细胞内IκB和pJNK含量及NF-κB活性的影响。结果显示:1)浓度为2μg/ml的M2蛋白刺激24h时,U937细胞表面TLR4阳性表达率即有显著增高,但并无浓度依赖性。2)浓度为50μg/ml的M2蛋白刺激U937细胞1h,细胞质内IκB即显著减少,甚至消失;至2h,I-κB又逐渐增加,但仍明显少于空白对照;至4h,I-κB已恢复至空白对照水平。以TLR4单克隆抗体HTA125阻断TLR4通路后,再以浓度为50μg/ml的M2蛋白刺激U937细胞1h、2h,I-κB较阻断前显著增加,但仍明显低于空白对照;至4h,阻断后较阻断前无明显变化。浓度为50μg/ml的线粒体M2蛋白刺激U937细胞1h、2h和4h,均未检测到pJNK。浓度为50μg/ml的线粒体M2蛋白刺激U937细胞1h,NF-κB活性即显著增加;至2h,又逐渐降低;至4h,已明显降低。以HTA125阻断TLR4通路后,再以浓度为50μg/ml的线粒体M2蛋白刺激U937细胞1h、2h和4h,NF-κB活性较阻断前显著降低,尤其是刺激4h时,细胞核内已基本检测不出具有结合DNA活性的NF-κB。3)浓度为50μg/ml的M2蛋白刺激U937细胞24h,TNF-α和sTRAIL浓度显著高于空白对照,IL-12与空白对照无明显差异;至48h,TNF-α、IL-12和sTRAIL的浓度均较24h显著增加;至72h,TNF-α和sTRAIL浓度较48h无显著变化,IL-12浓度较48h显著增加。以HTA125阻断TLR4通路后,各时间点三种细胞因子的浓度均较阻断前显著降低。与此相似,以PDTC阻断NF-κB后,各时间点三种细胞因子的浓度均较阻断前显著降低。本部分研究结果表明,线粒体M2蛋白可以上调单核细胞TLR4的表达,通过活化TLR4信号转导通路并以NF-κB依赖途径促进单核细胞分泌TNF-α、IL-12和sTRAIL等细胞因子,直接损伤HIBEC或调节其它免疫细胞杀伤HIBEC,引起PBC发病。
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