西瓜连作土传枯萎病微生物生态学机理及其生物防治

论文摘要

西瓜（Citrullus lanatus（Thunb）Matsum & Nakai）原产非洲赤道附近和地中海地区,是世界上的重要的园艺作物,是世界十大水果之一,尤其在夏季水果中占有十分突出的地位,其栽培面积与总产量均在世界水果前列。公元4-5世纪时,由西域传至我国,我国是世界上最大的西瓜产地,占世界西生产总面积和总产量的45%以上,2006年我国西瓜种植面积178.5万公顷、总产量6261.3万吨。但是由于长期连作,西瓜产生严重的连作障碍问题。种子发芽率降低、发芽缓慢、胚根不长或难以长大、很难出土,或出土后呈现失水状,生长缓慢,苗期容易死苗、倒伏,瓜蔓生长衰弱、矮化,叶片发黄,容易发病,特别是枯萎病,造成西瓜植株枯萎死亡,产量和品质下降。通常情况下由于枯萎病造成西瓜产量损失15-30%,严重田块达50-85%,甚至绝收,连作障碍中的枯萎病问题已经成为西瓜生产的主要限制因子。本研究从寄主-病原-环境三者生态互作角度出发,分别研究了西瓜连作障碍土中可培养微生物的区系变化、微生物多样性变化、西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.niveum）与其它可培养微生物的相互作用、西瓜尖孢镰刀菌毒素镰刀菌酸对西瓜幼苗氮素代谢、细胞跨膜电位、抗氧化酶和病程相关蛋白及光合作用的影响、西瓜根系分泌物和腐解物对尖孢镰刀菌生长和毒力的影响、西瓜根系分泌物中主要化感物质酚酸对西瓜尖孢镰刀菌的生长和毒力因子的影响、土壤生态环境条件对西瓜尖孢镰刀菌生长的影响、休闲条件下西瓜连作障碍土的微生物多样性和优势种群的变化、生物有机肥对西瓜枯萎病的防治效果等,取得了下列结果或结论。从上海松江塑料大棚连续种植5年西瓜的土壤和没有种植西瓜的非连作土中共获得微生物分离物243株,经平板培养特征镜检及生理生化特征鉴定,最终确认52种。其中细菌12种,放线菌14种,真菌20种,镰刀菌6种。非连作土中细菌12种,连作土细菌11种,比对照（非连作土）少1种。非连作土和连作土中放线菌都是12种。非连作土中真菌18种,连作土中真菌20种,比对照多2种。非连作土中镰刀菌5种,连作土中镰刀菌6种,比对照多1种。连作西瓜后土壤中微生物丰度发生显著变化,而多度基本不变。西瓜尖孢镰刀菌在室内抑制土壤中83.3%的细菌、85.7%的放线菌、31.6%的真菌和20.0%的镰刀菌。与此同时西瓜尖孢镰刀菌也受到土壤中土著拮抗细菌Bacillus subtilis,Psedomonas putida,拮抗放线菌Spirillospora Couch（1963）和Streptomyces longispororuber Krass（1941）,拮抗真菌PenicillumSimplicissimum（Oud.）Thom,Penicillium nigricans Bainier,Rhizoctonia DC.EX Fr.,Stysanus stemonite s（Pers.）Corda,Cephalosporium Corda,Westerdykella Stolk,Aspergillus effusus Tiraboschi等的竞争抑制和拮抗作用,但是拮抗细菌的拮抗作用远小于拮抗放线菌和拮抗真菌,因而导致总体上西瓜连作土中细菌群落数量大幅下降,放线菌和真菌群落数量大幅上升。西瓜尖孢镰刀菌对土壤中的细菌和放线菌的影响主要是营养竞争作用,对真菌和镰刀菌的作用是营养竞争和分泌次生代谢产物拮抗。采用人工培养收集西瓜根系分泌物添加到相关培养基中培养西瓜尖孢镰刀菌,考察不同生态型西瓜根系分泌物对病原菌尖孢镰刀菌的影响。感病品种（早佳84-24）和抗病品种（京欣1号和豫星3号）根系分泌物在低浓度(＜50 mg.L-1)时都能促进尖孢镰刀菌生长,但抗病品种在较高浓度时抑制尖孢镰刀菌生长。感病品种大大促进尖孢镰刀菌产毒,同时开花后根系分泌物促进尖孢镰刀菌的产毒量大于开花前。感病品种还大大促进尖孢镰刀菌毒力因子活性提高（蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和淀粉酶）。液相色谱分析结果显示,抗病品种西瓜根系分泌物含有比感病品种高得多的抑制真菌酚酸（对-羟基苯甲酸、邻苯二甲酸,五倍子酸、香豆酸、肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸和水扬酸）/促进真菌酚酸（香草酸和丁香酸）比值,开花后比开花前高,从而引起西瓜对病原菌不同的反应。采用不同基因型西瓜植株腐解物提取物加入到培养基中,研究西瓜腐解物对枯萎病病原菌尖孢镰刀菌的化感效应。用液相色谱仪分析了西瓜（早佳84-24、京欣1号）腐解物中的12种酚酸物质。结果显示,感病西瓜品种（早佳84-24）腐解物中所检测到的化学成分种类和数量少于抗病品种（京欣1号）。抗病品种含有更多的抗真菌物质,其抑制真菌酚酸/促进真菌生长酚酸比为29.2∶1,而感病品种则含量较少,其抑制真菌酚酸/促进真菌生长酚酸比为8.4∶1。抗病西瓜腐解物抑制病菌生长和孢子形成,而感病品种则抑制生长和产孢。抗病西瓜腐解物对尖孢镰刀菌毒力因子的刺激作用远远小于感病西瓜。所以可以推断,西瓜抗病/感病与否和它们的植株残体在土壤中分解产生的抑制真菌酚酸/促进真菌生长酚酸比密切相关。在实验室条件下,采用在培养基内人工添加不同酚酸（苯甲酸、对-羟基苯甲酸、香豆酸、肉桂酸、阿魏酸、五倍子酸、咖啡酸、芥子酸、水扬酸、丁香酸、香草酸、鞣酸）培养西瓜尖孢镰刀菌,考察这些植物体内产生和分泌的化感物质对西瓜枯萎病病原菌的影响。结果表明大多数酚酸都能抑制尖孢镰刀菌的生长和孢子萌发（苯甲酸、对-羟基苯甲酸、香豆酸、肉桂酸、阿魏酸、五倍子酸、咖啡酸、芥子酸和水扬酸）,少部分促进菌丝生长和孢子萌发（香草酸、丁香酸和鞣酸）。抑制尖孢镰刀菌菌丝生长的酚酸不一定抑制尖孢镰刀菌的毒性因子（产毒能力和致病酶）,促进尖孢镰刀菌菌丝生长的不一定促进毒性因子,可能是因为菌丝生长和毒性因子的形成是两个不同的机理和过程,酚酸对它们的作用位点和方式不同。采用大田西瓜连作障碍土,放置水泥池中,做成土模,保持露天状态,连续3年休闲（2005-2007）,研究西瓜连作障碍土微生物区系变化、多样性变化、优势种群变化、西瓜连作障碍的主要因子尖孢镰刀菌西瓜专化型的变化等,了解连作障碍土休闲条件下自然修复过程。结果表明,西瓜连作障碍土中微生物多样性发生显著改变,微生物生态平衡破坏。经过连续3年休闲自然修复后,微生物多样性得到恢复,土壤中优势细菌种群数量（丰度）增加118-177%;放线菌、真菌和病原菌种群数量减少,分别只有第1年的68-77%、63-67%和60-85%;病原菌西瓜尖孢镰刀菌只有第1年的50%左右;土壤中细菌∶放线菌∶真菌∶镰刀菌比由休闲前的24000∶100∶4∶1变化到休闲3年后的57000∶100∶3.5∶1,但与非连作土的560000∶400∶8∶1还相差很远,土壤逐渐由“真菌型”向“细菌型”过渡,说明连作障碍土的微生物平衡逐渐恢复,土壤生态和生产功能也将逐渐恢复。长期大量施用化学农药防治西瓜枯萎病已造成病菌的抗药性上升,药效下降,同时大量残留在土壤和水果中的农药还污染环境危害人体健康,因此为了农业可持续发展和生态平衡,有必要开发新型高效、低度、无污染的防治措施,生物防治是其中的一种。本研究中筛选几种实验室有一定拮抗作用的拮抗菌,经温室灭菌土壤接种西瓜尖孢镰刀菌后,从中选择2株有较好效果的拮抗菌（Panebacillus polymixa,Trichoderma harzianum）和有机肥（菜子饼发酵产物）混合处理,进行温室条件下的防治西瓜枯萎病试验。结果表明,在实验室平板有拮抗效果的12株菌,在灭菌土壤接种西瓜尖孢镰刀菌后30D后,只有6株表现较好的抑制效果,选择其中2株与有机肥复配后,在温室条件下施用到西瓜连作发病土中,栽培西瓜63D后,有机肥和生物有机肥都表现了一定的防治效果。其中0.5%有机肥和0.5%生物有机肥防治效果最好,分别达35.7%和64.5%。通过西瓜植株根茎叶等的MDA含量和抗氧化酶活性及病程相关蛋白含量的变化,推测生物有机肥防病的机理是提高西瓜体内抗性酶活性,诱导植株系统获得抗性,从而达到抑制尖孢镰刀菌的作用,具体机理有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语及专有词汇检索表
• 主要仪器和化学试剂检索表
• 1.仪器
• 2.试剂
• 第一部分 文献综述
• 第一章、西瓜连作障碍及枯萎病研究综述
• 1.西瓜生产及西瓜连作障碍的各种表现及成因
• 2.研究西瓜连作障碍及枯萎病的目的和意义
• 3.西瓜枯萎病的发生发展条件和表现及其危害
• 4.西瓜枯萎病病原菌的生物学特征及生活史
• 5.西瓜尖孢镰刀菌研究进展
• 6.西瓜枯萎病的防治
• 6.1 物理防治
• 6.2 化学防治
• 6.3 农业防治
• 6.4 选育抗枯萎病西瓜品种
• 6.5 生物防治
• 6.6 现行方法的优缺点比较及未来发展方向
• 第二部分 研究报告
• 第二章、西瓜连作土壤中微生物区系分析及可培养微生物分离鉴定
• 1.材料方法
• 1.1 供试土壤
• 1.2 微生物区系分析及可培养微生物分离鉴定培养基
• 1.2.1 细菌培养基
• 1.2.2 放线菌培养基
• 1.2.3 真菌培养基
• 1.2.4 镰刀菌培养基
• 1.3 土壤微生物的分离、计数
• 1.4 可培养微生物物种丰度、多度、及生物多样性计算
• 1.5 所用仪器和化学试剂
• 1.6 数据处理
• 2.结果分析
• 2.1 西瓜连作土中微生物区系分析
• 2.2 西瓜连作土中可培养细菌的分离鉴定
• 2.3 西瓜连作土中可培养放线菌的分离鉴定
• 2.4 西瓜连作土中可培养真菌的分离鉴定
• 2.5 西瓜连作土中可培养镶刀菌的分离鉴定
• 2.6 西瓜连作土中可培养微生物多样性变化
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 第三章、西瓜连作土中尖孢镶刀菌西瓜专化型分离、鉴定及休闲后微生物区系和微生物多样性变化
• 1.材料方法
• 1.1 菌株分离鉴定及纯化培养
• 1.2 供试作物品种
• 1.3 生理生化试验
• 1.3.1 温度试验
• 1.3.2 pH试验
• 1.3.3 生长曲线
• 1.3.4 产毒试验
• 1.3.5 产酶试验
• 1.4 西瓜枯萎病病原菌的分子生物学特征鉴定
• 1.4.1 西瓜尖孢镰刀菌菌丝体基因组总DNA的提取
• 1.4.2 西瓜尖孢镰刀菌基因组总DNA片段扩增的引物设计和PCR扩增
• 1.4.3 基因组DNAPCR产物纯化、回收及其与pMD19-T载体连接T/A克隆
• 1.4.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备和转化
• 1.4.5 质粒DNA的小量提取
• 1.4.6 质粒DNA的小量酶切验证
• 1.4.7 DNA序列测定
• 1.4.8 西瓜尖孢镰刀菌系统发育地位
• 1.5 供试土壤
• 1.6 土壤微生物区系分析培养基（见第二章）
• 1.8 土壤样品的采集及微生物的分离、计数
• 1.9 可培养微生物物种丰度、多度、及生物多样性计算（见第二章）
• 1.10 数据处理
• 1.11 所用仪器和化学试剂
• 2.结果分析
• 2.1 尖孢镰刀菌菌株分离鉴定
• 2.2 回接发病试验
• 2.3 尖孢镰刀菌西瓜专化型鉴定
• 2.4 西瓜尖孢镰刀菌分子生物学特征鉴定
• 2.5 尖孢镰刀菌西瓜专化型生理生化特征
• 2.6 休闲条件下西瓜连作土中微生物丰度的季节变化
• 2.7 休闲条件下西瓜连作土中微生物丰度的不同年度变化
• 2.8 西瓜连作土休闲过程中西瓜尖孢镰刀菌丰度的变化
• 2.9 西瓜连作土休闲过程中微生物多样性变化
• 2.10 西瓜连作土休闲后优势微生物种群的变化
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 第四章、西瓜连作土中尖孢镰刀菌西瓜专化型与其它可培养微生物生态互作关系
• 1.材料方法
• 1.1 病原菌培养方法
• 1.2 西瓜尖孢镰刀菌液体培养及毒素提取
• 1.3 所用仪器和化学试剂
• 2.结果分析
• 2.1 西瓜连作土中可培养细菌与尖孢镰刀菌西瓜专化型相互作用
• 2.2 西瓜连作土中可培养放线菌与尖孢镰刀菌西瓜专化型相互作用
• 2.3 西瓜连作土中可培养真菌与尖孢镰刀菌西瓜专化型相互作用
• 2.4 西瓜连作土中可培养镰刀菌与尖孢镰刀菌西瓜专化型相互作用
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 第五章、西瓜根系分泌物对尖孢镰刀菌生长和毒性因子的影响
• 1.材料方法
• 1.1 病原菌和西瓜品种
• 1.2 西瓜根系分泌物收集、纯化、浓缩
• 1.3 根系分泌物液相色谱测定
• 1.4 西瓜根系分泌物对尖孢镰刀菌菌落生长
• 1.5 孢子萌发测定
• 1.6 生物量和水解酶活测定
• 1.7 产孢测定
• 1.8 真菌毒素提取和测定
• 1.9 试验设计和数据分析
• 1.10 所用仪器试剂
• 2.结果分析
• 2.1 西瓜根系分泌物中酚酸成分及含量分析
• 2.2 西瓜根系分泌物对尖孢镰刀菌生物量和菌落生长的影响
• 2.3 对孢子萌发和产孢影响
• 2.4 对产毒的影响
• 2.5 对水解酶活性的影响
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 第六章、西瓜植株腐解物对尖孢镰刀菌生长和毒性因子的影响
• 1.材料方法
• 1.1 病原菌和西瓜品种
• 1.2 西瓜腐解物浸提物收集、纯化、浓缩
• 1.3 西瓜腐解物液相色谱测定
• 1.4 尖孢镰刀菌生长测定
• 1.5 生物量和水解酶活测定
• 1.6 产孢测定
• 1.7 真菌毒素提取和测定
• 1.8 试验设计和数据分析
• 1.9 所用仪器试剂
• 2.结果分析
• 2.1 西瓜植株腐解物中酚酸成分及含量分析
• 2.2 西瓜植株腐解物浸提物对尖孢镰刀菌生物量和菌落生长的影响
• 2.3 对尖孢镰刀菌产孢影响
• 2.4 对尖孢镰刀菌产毒影响
• 2.5 对尖孢镰刀菌水解酶活性的影响
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 第七章、外源酚酸对尖孢镰刀菌生长和毒性因子的影响
• 1.材料方法
• 1.1 病原菌和西瓜品种
• 1.2 酚酸对尖孢镰刀菌菌落生长
• 1.3 孢子萌发测定
• 1.4 生物量和水解酶活测定
• 1.5 产孢测定
• 1.6 真菌毒素提取和测定
• 1.7 试验设计和数据分析
• 1.8 所用仪器试剂
• 2.结果
• 2.1 酚酸对尖孢镰刀菌菌丝和菌落生长影响
• 2.2 酚酸对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响
• 2.3 酚酸对尖孢镰刀菌产孢的影响
• 2.4 酚酸对尖孢镰刀菌产毒的影响
• 2.5 酚酸对尖孢镰刀菌水解酶活性的影响
• 2.6 酚酸对尖孢镰刀菌总体影响
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 第八章、西瓜枯萎病的生物防治
• 1.材料方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 不同拮抗菌对尖孢镰刀菌的影响
• 1.2.2 有机肥对尖孢镰刀菌的影响
• 1.2.3 生物有机肥对尖孢镰刀菌的影响
• 1.2.4 相关指标生物测定及发病考察和防治效果评估
• 1.2.5 数据处理和统计分析
• 1.3 所用仪器及试剂
• 2.结果
• 2.1 不同拮抗菌对尖孢镰刀菌的影响
• 2.2 有机肥对尖孢镰刀菌的影响和对枯萎病的防治
• 2.3 有机肥和生物有机肥对尖孢镰刀菌的影响
• 2.3.1 有机肥和生物有机肥对西瓜枯萎病的防治
• 2.3.2 有机肥和生物有机肥对西瓜细胞膜脂质过氧化的影响（MDA）
• 2.3.3 有机肥和生物有机肥对西瓜鲜重的影响
• 2.3.4 有机肥和生物有机肥对西瓜过氧化氢酶（CAT）的影响
• 2.3.5 有机肥和生物有机肥对西瓜过氧化物酶（POD）的影响
• 2.3.6 有机肥和生物有机肥对西瓜超氧化物酶（SOD）的影响
• 2.3.7 有机肥和生物有机肥对西瓜细胞β-1,3-葡聚糖酶的影响
• 2.3.8 有机肥和生物有机肥对西瓜细胞几丁质酶的影响
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 参考文献
• 全文讨论
• 1.西瓜连作障碍与枯萎病的关系
• 2.西瓜-尖孢镰刀菌-土壤生态三角关系
• 3.拮抗菌与枯萎病的关系
• 全文结论
• 研究创新点
• 附件
• 附件一:尖孢镰刀菌对西瓜幼苗生长和相关生理生化参数的影响
• 1.材料方法
• 1.1 尖孢镰刀菌对不同抗性品种西瓜幼苗的致病率
• 1.1.1 供试西瓜品种
• 1.1.2 试验方法
• 1.2 尖孢镰刀菌毒素对西瓜种子发芽影响
• 1.2.1 尖孢镰刀菌培养及毒素的浓缩纯化
• 1.2.2 西瓜种子处理及萌发试验
• 1.2.3 西瓜种子发芽势和发芽率
• 1.3 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗根系生长及生物量的影响
• 1.4 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗叶绿素及光合作用的影响
• 1.5 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗根系活力及抗氧化酶的影响
• 1.5.1 根系脱氢酶活性的测定
• 1.5.2 抗氧化酶及脂质过氧化测定
• 1.6 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗病程相关蛋白的影响
• 1.6.1 β-1,3-葡聚糖酶测定
• 1.6.2 几丁质酶测定
• 1.7 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗根细胞跨膜电位的影响
• 1.8 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗氮素代谢的影响
• 1.8.1 西瓜幼苗预处理培养条件及试验设计
• 1.8.2 植株酶提取和测定
• 1.9 数据统计处理
• 1.10 所用仪器试剂
• 2.结果分析
• 2.1 尖孢镰刀菌对不同抗性品种西瓜幼苗的致病率
• 2.2 尖孢镰刀菌毒素（FA）对西瓜种子发芽影响
• 2.3 尖孢镰刀菌毒素（FA）对西瓜幼苗根系生长及生物量的影响
• 2.4 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗叶绿素及光合作用的影响
• 2.4.1 对光合作用的影响
• 2.4.2 对叶绿素含量的影响
• 2.5 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗根系活力及抗氧化酶的影响
• 2.5.1 对根细胞脱氢酶活性影响
• 2.5.2 对叶片细胞膜脂质过氧化及丙二醛的影响
• 2.5.3 FA对叶片抗氧化酶活性影响
• 2.6 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗叶片细胞病程相关蛋白的影响
• 2.6.1 对β-1,3葡聚糖酶影响
• 2.6.2 对几丁质酶活性影响
• 2.7 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗根细胞跨膜电位的影响
• 2.8 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗氯素代谢的影响
• 2.8.1 FA对西瓜叶片中不同形态氮素含量得影响
• 2.8.2 对相关氮代谢酶的影响
• 3.讨论
• 3.1 西瓜尖孢镰刀菌对西瓜种子萌发和幼苗生长的影响
• 3.2 尖孢镰刀菌对西瓜幼苗叶片叶绿素和光合作用的影响
• 3.3 尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗根系功能和叶片抗氧化酶及病程相关蛋白影响
• 4.本章小结
• 附件二:土壤环境生态因子对尖孢镰刀菌生长的影响
• 1.材料方法
• 1.1 温度对尖孢镰刀菌孢子萌发和菌落生长的影响
• 1.2 湿度对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响
• 1.3 氧气对尖孢镰刀菌孢子萌发和菌落生长的影响
• 1.4 pH对尖孢镰刀菌的影响
• 1.5 腐殖酸对尖孢镰刀菌的影响
• 1.6 紫外线对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响
• 1.7 杀虫剂对尖孢镰刀菌菌落生长的影响
• 1.8 杀菌剂对尖孢镰刀菌菌落生长的影响
• 1.9 除草剂对尖孢镰刀菌菌落生长的影响
• 1.10 盐分对尖孢镰刀菌的影响
• 1.11 有机酸对尖孢镰刀菌的影响
• 1.12 氨基酸对尖孢镰刀菌的影响
• 1.13 化学肥料对尖孢镰刀菌的影响
• 1.14 所用仪器和化学试剂
• 2.结果分析
• 2.1 温度对尖孢镰刀菌孢子萌发和菌落直径生长的影响
• 2.2 湿度对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响
• 2.3 氧气对尖孢镰刀菌孢子萌发和菌落直径的影响
• 2.4 pH对尖孢镰刀菌菌落生长影响
• 2.5 腐殖酸对尖孢镰刀菌生长的影响
• 2.6 紫外线对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响
• 2.7 杀虫剂对尖孢镰刀菌菌落生长的影响
• 2.8 杀菌剂对尖孢镰刀菌菌落生长的影响
• 2.9 除草剂对尖孢镰刀菌菌落生长的影响
• 2.10 盐分对尖孢镰刀菌的影响
• 2.11 有机酸对尖孢镰刀菌的影响
• 2.12 氨基酸对尖孢镰刀菌的影响
• 2.13 化学肥料对尖孢镰刀菌的影响
• 3.讨论
• 4.本章小结
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的SCI论文