利用RNAi沉默橘小实蝇生殖相关基因的研究

论文摘要

橘小实蝇Bactrocera dorsalis （Hendel）是国内毁灭性果蔬害虫,其主要以幼虫潜食为害,影响多种水果的产量与品质。目前,对橘小实蝇的防治研究主要是生物防治和诱剂研究等传统的防治方法,分子生物学水平的防治研究领域还处于空白。RNAinterference （RNAi）是利用dsRNA诱导序列特异的转录后基因沉默,在多种昆虫中已经通过喂食法成功实现了靶标基因的沉默,但在双翅目昆虫中仍未建立成功的喂食法RNAi技术平台。本研究选取生殖相关基因noa和rab11作为靶标基因,通过分别构建noa、rab11dsRNA表达载体和利用Real-time PCR等基因工程和分子生物学技术从靶标基因表达水平、产卵量和死亡率等方面探讨了喂食法在橘小实蝇中实现RNAi的可行性,为RNA干扰在害虫防治领域的普遍应用提供理论依据和新的思路。成功克隆了橘小实蝇noa、rabl1两个产卵相关基因cDNA片段,分别为全长的51%和92%。通过BLAST进行核酸序列分析,结果表明这两个基因片段所在区域均与果蝇的同源性最高,分别为82%、85%。利用CLUSTAL X2.0分析其氨基酸片段序列,结果表明橘小实蝇noa、rabl1基因与果蝇在获得片段所在区域内的同源性分别为94%和98%。通过分别构建表达noa、rabll dsRNA的载体,在大肠杆菌HT115中诱导表达其相应的dsRNA。Real-time PCR结果表明,与对照组相比,dsRNA饲喂法和菌液饲喂法均可以使靶标基因表达量下调,noa、rab11的最大下调量分别为71.3%和66.7%。此外与对照组相比,noa、rab11 RNAi均可以在一定程度上导致产卵量的下降,同时,通过dsRNA喂食法实现的rab11RNAi可以导致成虫20%的死亡率。在持续饲喂dsRNA和表达dsRNA的菌液的14天中,靶标基因均出现了过表达现象。与对照组相比,生测组rabl1在dsRNA饲喂法的第七天达到最大上调量14.77倍,生测组noa在菌液饲喂法的第二天达到最大上调量2.55倍。本研究得到以下结论：通过dsRNA畏食法和菌液喂食法均可以在橘小实蝇中实现靶标基因的沉默。同时,持续喂食dsRNA或表达dsRNA的菌液均可以导致靶标基因的超表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 橘小实蝇生物学特性
• 2 橘小实蝇的分子生物学研究
• 3 RNAi及其分子机制
• 4 昆虫RNAi dsRNA的导入方法
• 4.1 注射法
• 4.2 饲喂法
• 4.3 组织培养法
• 5 昆虫RNAi及其应用
• 5.1 昆虫RNAi的持久性
• 5.2 昆虫RNAi的系统性
• 5.3 昆虫RNAi的可遗传性
• 5.4 RNAi在昆虫中应用进展
• 6 noa和rab11在生殖方面的功能研究
• 7 本研究的目的意义及创新点
• 7.1 本项研究的目的意义
• 7.2 本项研究的创新点
• 8 本研究的技术路线
• 第二章 橘小实蝇noa、rab11基因片段的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 橘小实蝇总RNA的提取
• 2.2 RT-PCR扩增相关基因片段
• 2.3 PCR产物的的克隆与测序
• 3 小结
• 第三章 橘小实蝇noa和rab11基因RNAi效应研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 目的片段的扩增
• 2.2 双酶切反应
• 2.3 表达载体的筛选与鉴定
• 2.4 dsRNA的表达
• 2.5 RNAi干扰效应的检测
• 3 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录