论文摘要
[目的]：探讨急性有机磷中毒（acute organophosphorus pesticides poisoning, AOPP）大鼠的心肌损伤表现及其发生机制；阐明Rho/ROCK信号转导通路抑制剂法舒地尔（Fasudil, Fas）对损伤心肌的保护作用及机制。[方法]清洁级雄性Sprague Dawley （SD）大鼠采用腹腔注射敌敌畏（dichlorvos, DDVP）制备急性有机磷中毒（acute organophosphorus pesticides poisoning,AOPP）大鼠模型。实验大鼠随机分成对照组、中毒组、大剂量Fas干预（H-Fas）组、小剂量Fas干预（L-Fas）组4组,各8只。麻醉后,行气管插管术,接DW-2000动物人工呼吸机辅助通气。对照组经腹腔注射0.4mL生理盐水；中毒组和干预组：经腹腔注射60mg/kg DDVP （2LD50）;干预组在麻醉前30分钟经腹腔注射Fas 10mg/kg、1mg/kg。记录II导联心电图。每组大鼠在术后6小时,采集血标本,用于检测血清心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T, cTnT）和脑钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide, NT-proBNP）水平。采血后,取左心室心肌组织标本,HE染色观察病理改变,脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）进行凋亡计数；免疫组化法测定bax、bcl-2值；逆转录—聚合酶链式反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）法检测左心室心肌RhoAmRNA、ROCKImRNA表达;免疫蛋白印迹法（Western blot, W-B）测定左心室心肌肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1（myosin phosphatase target subunit 1, MYPT1）磷酸化水平。[结果]一、大鼠一般情况对照组大鼠无异常表现,EKG正常。中毒组大鼠在腹腔注射DDVP后出现呼吸道分泌物增多,肌肉颤动,呼吸抑制,两便失禁等AOPP症状。EKG提示心肌损伤及心律失常,表现为ST-T改变,恶性心律失常（极度心动过缓、室速、室颤等）。所有症状在中毒后5-7分钟出现并达到发作高峰,持续30-60分钟。H-Fas组的症状相对较轻,分泌物较少,肌肉颤动幅度与频率小,EKG表现有所改善。L-Fas组的症状介于中毒组与H-Fas组之间。中毒组死亡2只,L-Fas组死亡1只。对照组与H-Fas组死亡0只。二、血生化指标测定（一）血清cTnT值（ng·ml-1）：1.与对照组（0.01±0.00）比,中毒组血清cTnT值（0.12±0.04）显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。2.与中毒组（0.12±0.04）比,H-Fas干预组血清cTnT值（0.04±0.02）明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。L-Fas组血清cTnT值（0.13±0.07）无变化,差异无统计学意义（P>0.05）。（二）血清NT-proBNP值（pg·ml-1）1.与对照组（55.94±4.80）比,中毒组血清NT-proBNP值（119.92±41.84）显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。2.与中毒组（119.92±41.84）比,H-Fas干预组与L-Fas组血清NT-proBNP值（51.86±7.94；60.35±5.58）均明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。H-Fas干预组与L-Fas组之间比变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）。三、左心室心肌病理学改变大鼠左心室心肌组织HE染色显示,对照组心肌组织未见异常改变。中毒组心肌组织可见充血水肿、炎症细胞浸润、组织坏死。H-Fas组心肌组织损伤明显减轻,心肌细胞结构完整,仅有少量炎性细胞浸润,未见大片充血坏死。L-Fas组则介于两者之间。四、左心室心肌凋亡计数以心肌细胞凋亡指数（apoptosis inde, AI）作为检测指标,TUNEL法检测结果可见：1.与对照组（5.20±0.52%）比,中毒组大鼠心肌凋亡细胞数明显增加,AI值（25.60±3.83%）明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.与中毒组（25.60±3.83%）比,H-Fas组心肌凋亡细胞数明显减少,AI值（15.14±2.61%）明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。L-Fas组虽然凋亡心肌细胞数减少,AI值（22.57±4.73%）有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。五、左心室心肌组织bax、bcl-2值测定1.与对照组比较：中毒组心肌组织bax表达明显增多（36.65±8.13 vs 17.97±2.91）,bcl-2表达明显增多（20.27±5.93 vs 12.83±1.64）,bax/bcl-2比值明显升高（2.07±1.05 vs 1.43±0.38）,差异有统计学意义（P<0.05）。2.与中毒组比较：H-Fas组心肌组织bax表达显著受抑（15.57±3.63 vs36.65±8.13）,bcl-2表达显著增多（34.18±6.88 vs 20.27±5.93）,bax/bcl-2比值显著下降（0.48±0.16 vs 2.07±1.05）,差异有统计学意义（P<0.05）。L-Fas组心肌组织bax表达受抑（23.31±9.60 vs 36.65±8.13）,bcl-2表达增多（24.31±9.96 vs 20.27±5.93）,bax/bcl-2比值下降（0.79±0.13 vs 2.07±1.05）,差异有统计学意义（P<0.05）。与L-Fas组比,H-Fas组心肌组织bax表达明显受抑,bcl-2表达明显增多,差异有统计学意义（P<0.05）；而bax/bcl-2比值,两者比虽有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。六、RT-PCR法检测RhoA mRNA及ROCKI mRNA值（一）心肌组织RhoA mRNA值1.与对照组（0.97±0.04）比：中毒组心肌组织RhoA mRNA（1.48±0.25）表达显著增多,差异有统计学意义（P<0.05）。2.与中毒组（1.48±0.25）比：H-Fas组心肌组织RhoA mRNA （1.06±0.17）表达受到显著抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。L-Fas组心肌组织RhoA mRNA（1.29±0.11）表达受到抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。与L-Fas组比,H-Fas组心肌组织RhoA mRNA表达明显受抑,差异有统计学意义（P<0.05）。（二）心肌组织ROCKI mRNA值1.与对照组（1.03±0.07）比：中毒组心肌组织ROCKI mRNA （1.56±0.24）表达显著增多,差异有统计学意义（P<0.05）。2.与中毒组（1.56±0.24）比：H-Fas组心肌组织ROCKI mRNA （1.14±0.19）表达受到显著抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。L-Fas组（1.35±0.10）心肌组织ROCKI mRNA表达受到显著抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。与L-Fas组比,H-Fas组心肌组织ROCKI mRNA表达明显受抑,差异有统计学意义（P<0.05）。七、左心室心肌W-B检测以MYPT1磷酸化程度来代表ROCKI活化程度。MYPTl磷酸化程度以P-MYPT1与内参蛋白电泳条带灰度值的比值表示。活化程度由高到低依次如下：中毒组（0.12±0.00）、L-Fas组（0.10±0.01）、H-Fas组（0.09±0.01）、对照组（0.09±0.00）。中毒组与对照组比,比值显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。干预组与中毒组比,比值显著下降,差异有统计学意义（P<0.05）。与L-Fas组比,H-Fas组比值明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。[结论]一、AOPP时存在心肌损伤,法舒地尔对AOPP所致心肌损伤有保护作用。二、AOPP寸的心肌损伤与Rho/ROCK信号转导通路的激活有关。法舒地尔通过抑制Rho/ROCK信号转导通路,下调bax/bcl-2比值,抑制心肌细胞凋亡,减轻心肌损伤,起到心肌保护作用。
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