论文摘要
第一章SD大鼠胰岛素抵抗非酒精性脂肪肝病模型的构建目的:构建SD大鼠胰岛素抵抗（IR）非酒精性脂肪肝病（NAFLD）动物模型。方法:雄性SD大鼠32只,随机分为正常饮食组和高脂饮食组各16只。正常饮食组喂养普通饲料（脂肪占摄入能量的19%）,高脂饮食组喂养高脂饲料（脂肪占摄入能量的45%）,喂养8周。8周末使用正常血糖—高胰岛素钳夹技术稳态时的葡萄糖输注率（GIR）来评价胰岛素敏感性;抽取门静脉血测定空腹血糖（FBS）、空腹胰岛素（FINS）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）;游离肝脏称肝湿重,计算肝指数（肝湿重（g）/体重（g）×100%）;光镜下HE染色和苏丹三染色对肝脏的脂肪变性情况进行评定。结果:肝组织病理学检查显示,高脂饮食组大鼠肝细胞均呈现弥漫性大泡性脂肪变性,发展为NAFLD,正常饮食组肝脏无异常;与正常饮食组相比,高脂饮食组大鼠肝指数、GIR、FIRI、血清ALT、AST、胰岛素、TG、TC均明显增高,比较均有统计学差异（p＜0.05）。结论:SD大鼠持续8周高脂饮食喂养成功构建了IR NAFLD动物模型。该模型的代谢特征为IR、高胰岛素血症、高脂血症及血清转氨酶升高第二章高脂饮食诱导SD大鼠胰岛素抵抗非酒精性脂肪肝病机制的初步探讨目的:探讨SD大鼠高脂饮食诱导胰岛素抵抗（IR）非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的分子机制:肝脏c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）蛋白表达及胰岛素受体底物-1丝氨酸307(IRS-1 Ser307)磷酸化水平的变化,阐明JNK1蛋白在NAFLD形成中对IR的作用的分子机制;氧化应激及脂肪因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）改变在IR NAFLD形成中的作用。方法:SD大鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组,喂养8周后处死动物留取标本,检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MAD）、游离脂肪酸（FFAs）及TNF-α的变化,应用免疫组织化学方法检测JNK1蛋白在肝组织中的表达,应用Western blot检测JNK1蛋白含量和IRS-1 Ser307磷酸化水平。结果:与正常饮食组大鼠相比,高脂饮食组大鼠的肝组织匀浆MDA、FFAs、TNF-α明显增高,SOD明显降低,均有统计学差异（P＜0.05）。JNK1蛋白免疫组织化学显示:与正常饮食组相比,高脂饮食组大鼠肝组织JNK1抗体阳性细胞胞浆染色棕褐色,正常饮食组大鼠肝组织无明显JNK1抗体阳性细胞,高脂饮食组大鼠肝组织JNK1抗体阳性细胞约10%。高脂饮食组JNK1蛋白表达增高,并与IR呈正相关,IRS-1 Ser307的磷酸化水平较正常饮食组明显增高,有统计学差异（P＜0.05）。结论:高脂饮食诱导的SD大鼠IR NAFLD的部分分子机制可能为:JNK1在肝脏表达增高,并通过上调IRS-1 Ser307磷酸化水平,干扰了胰岛素与胰岛素受体结合后的信号传导,最终减弱胰岛素的生理作用,导致IR;TNF-α及氧应激-脂质过氧化损伤是高脂饮食诱导IRNAFLD的机制之一。第三章应用AdEasy腺病毒载体系统构建WT-JNK1重组腺病毒目的:制备表达野生型c-Jun氨基末端激酶1（WT-JNK1）复制缺陷型重组腺病毒。方法:将重组穿梭载体pAdTrack-CMV-WT-JNK1线性化后,与pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组得到重组腺病毒载体。将重组腺病毒载体转染入包装细胞HEK293内制备复制缺陷型重组腺病毒,并经PCR及DNA测序鉴定,扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度。结果:JNK1重组腺病毒载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,搜集的病毒经过PCR扩增得到特定JNK1基因片段并测序鉴定正确,并扩增出2.5×1010pfu/ml的高滴度重组腺病毒。结论:该研究成功构建了JNK1重组腺病毒,为进一步研究JNK1的作用及应用JNK1进行相关疾病的基因防治研究奠定了基础。第四章应用腺病毒载体过表达WT-JNK1对NAFLD的影响及机理目的:应用腺病毒载体过表达野生型c-Jun氨基末端激酶1（WT-JNK1）基因,研究其对非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的形成过程的影响,进一步探讨JNK1在胰岛素抵抗（IR）NAFLD发病中的作用。方法:SD大鼠随机分为高脂对照组、Ad-GFP组、表达WT-JNK1的腺病毒（Ad-WT-JNK1）组。均用高脂饲料喂养8周。实验第一周,高脂对照组尾静脉注入生理盐水,Ad-GFP组尾静脉注入2×1010pfu的Ad-GFP,Ad-WT-JNK1组尾静脉注入2×1010pfu的Ad-WT-JNK1,8周末进行正常血糖高胰岛素钳夹实验检测IR;抽取门静脉血留取标本,检测空腹血糖（FBS）、空腹胰岛素（FINS）、甘油三脂（TG）、胆固醇（TC）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、游离脂肪酸（FFAs）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MAD）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等指标;观察肝组织脂肪变性;应用免疫组织化学方法检测JNK1蛋白在肝组织中的表达,应用Western blot检测JNK1蛋白含量和IRS-1 Ser307磷酸化水平。结果:与高脂对照组和Ad-GFP组相比较,Ad-WT-JNK1组大鼠肝组织脂肪变性明显加重,并出现炎症性改变,TG、TC、ALT、AST明显增高,高胰岛素血症进一步加重,IR水平更加严重;MDA及TNF-α水平明显增高,SOD水平明显降低;JNK1蛋白表达及IRS-1Ser307磷酸化水平明显增高,比较均有统计学差异（均P＜0.05）。与高脂对照组相比,Ad-GFP组大鼠动物的体重、肝指数、生化学指标、GIR、肝组织脂肪变性情况、JNK1蛋白表达及IRS-1 Ser307磷酸化水平均无明显差异。动物注射腺病毒后,均未出现皮肤过敏等反应异常,动物死亡等现象。结论:WT-JNK1重组腺病毒基因转染SD大鼠后,能明显上调JNK1蛋白的表达,通过作用于IRS-1 Ser307磷酸化导致IR,加重了NAFLD的发生和发展,腺病毒能够安全应用于SD大鼠IR NAFLD发病机制的研究。
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