论文摘要
动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是一种严重威胁人类健康和生命的慢性炎症疾病。AS的发展过程是缓慢而复杂的,从血脂代谢紊乱、内皮细胞损伤、炎症细胞侵入、泡沫细胞形成以及血管平滑肌细胞游走、增殖,到脂质条纹、纤维斑块乃至粥样斑块的形成过程中炎症反应起着重要的作用,目前对AS的早期发病机制还不明确,往往是血脂异常、糖代谢失衡以及炎症等多种危险因素并存,共同影响着AS的发生发展。趋化因子（chemokine）是细胞因子家族中的一员,趋化因子通过与受体的结合参与细胞的生长、增殖、分化和凋亡等多种生理功能,并在多种生理病理过程中发挥着重要的作用,如炎症反应、创伤修复、病原体感染以及肿瘤的形成和转移等。趋化因子及其受体作为联系氧化应激与炎症反应的纽带,通过受体介导的趋化作用和细胞间的黏附机制,参与AS的多个过程,如炎性细胞的募集与浸润、泡沫细胞的滞留与逸出、血管平滑肌细胞的激活与增殖等过程。研究趋化因子及其受体网络的调节机制将为动脉粥样硬化的治疗提供一种新的选择。目前,人们对趋化因子及其受体的结构、功能有了较全面的了解,大量研究表明,在AS形成过程中多种趋化因子及其受体起着重要作用。其主要利用相关基因缺失的小鼠模型和药物干预等方法,研究单个趋化因子和受体与AS的相关性,但是仍有很多趋化因子与AS的相关性未见报道,其中CCR3、CCR5及其配体在AS的发生发展过程中所起作用及其分子机制尚不清楚。ApoE基因缺失(apoE deficient, apoE-/-)小鼠在普通标准饮食条件下能够自发产生AS病变,且发病过程与人类AS极为相似,是研究人类AS的理想模型。因此,本实验以高脂饮食饲养的apoE-/-小鼠作为模型,通过血生化分析、病理形态学检测、Real-time PCR和免疫组织化学等实验技术,对小鼠的血脂水平、主动脉AS病变情况进行分析,并对CCR3、CCR5及其配体基因在AS发生发展过程中的表达变化规律进行系统的分析,同时检测了CCR5和CCL5在蛋白水平的表达和分布情况,着重探讨了CCR3、CCR5及其配体的表达与AS病变的关系,以及其中可能的导致AS病变的机制,有助于进一步阐明该疾病的发生机制,为进一步开展AS的基础应用性研究提供有价值的理论依据。实验结果显示:1.载脂蛋白E（apoE）是多种血浆脂蛋白的组成部分,脂蛋白通过apoE配体,与细胞表面的脂蛋白受体结合,促进脂蛋白进入肝细胞和肝外组织细胞进行分解代谢,在胆固醇等的运输和代谢中发挥重要作用。由于小鼠中apoE基因缺失,使富含甘油三酯和胆固醇的脂蛋白无法通过配体受体结合的方式进入细胞进行代谢,造成血浆中大量脂质不能及时清除而积累,进而出现高胆固醇血症。血生化分析结果显示,随着年龄的增加,apoE-/-小鼠血浆中的总胆固醇（total cholesterol, TC）水平有显著的变化,甘油三酯（triglyceride, TG）变化并不明显。高脂高胆固醇饮食处理后,血浆中TC水平显著升高,4周时达到最大值约56 mmol/L,在6周时开始缓慢下降,到饮食处理16周时,下降到40 mmol/L左右。血浆中TG的变化不明显,平均值在1.4 mmol/L左右。2.ApoE-/-小鼠主动脉根部连续冷冻切片,染色后光镜下检测发现,apoE-/-小鼠主动脉根部有明显的阳性染色区,表明主动脉根部瓣膜处的动脉壁发生脂质沉积,并伴有泡沫细胞的聚集,且随年龄的增长,病变程度逐渐加深。饮食处理16周时,小鼠主动脉根部AS病变区域增多,病变面积增大,管腔逐渐变小,平滑肌细胞增殖并迁移,进一步吞噬脂质,在病变严重的区域,斑块内部出现胆固醇结晶以及坏死核心。全长主动脉大体染色结果显示,主动脉病变部位的油红O阳性染色区主要分布于主动脉弓部、胸主动脉分支处和腹主动脉分支处,这些部位由于具有血管分支,剪切力较大,更容易发生脂质的沉积并产生病变斑块。实验结果表明,随着年龄的增长,小鼠全长主动脉的病变面积逐渐增大。3.本实验采用Real-time PCR的方法,检测了在AS发生发展过程中CCR3、CCR5及其多种配体CCL3（MIP-1α）、CCL4（MIP-1β）、CCL5（RANTES）、CCL11（eotaxin）和CCL26（eotaxin-3）mRNA水平的表达情况。结果显示,结合于同一种受体的多种配体具有不同的表达规律。随着AS病变程度的发展,趋化因子受体CCR5的表达水平呈上升趋势,高脂饮食处理12周时达到最大值,在随后的14-16周,表达量有所下降。CCR5配体的检测结果显示,随着病变的加重,趋化因子CCL3、CCL4表达水平持续上升,在饮食处理12周时到达最大值,然后表达量开始下降。而趋化因子CCL5表现出一种不同的表达模式,在AS病变的早期,CCL5的表达水平呈上升趋势,高脂饮食处理4周时到达最大值,6周时表达量开始下降,并一直持续到14周,16周时有所回升。从结果中得出,趋化因子CCL5的表达水平与AS的病变程度并非平行的关系,说明CCL5可能在AS的病变早期起到重要的作用,而在病变的晚期阶段,CCL5所起到的趋化作用被其他趋化因子或细胞因子所取代。同时,趋化因子受体CCR3及其配体的表达结果显示,随着AS病变的发展,CCR3表达水平上升,饮食处理12周时达到最大值,14周时开始下降,趋势与CCR5相似。其配体CCL11和CCL26的表达趋势却相差很大,CCL11的表达趋势与CCR3一致,而CCL26在AS病变的早期表达升高,这种表达水平的差异可能是由于不同的趋化因子在AS病变过程中所起的作用和起作用的时期有所不同,这一点值得我们做进一步的研究。4.本实验进一步采用免疫组织化学的实验技术,检测了CCR5和CCL5在AS病变部位的蛋白表达情况,并利用荧光抗体双标的方法,通过与AS病变部位不同类型细胞的标志性蛋白的共定位,进一步对CCR5和CCL5进行定性和定位。荧光免疫组化的结果显示,在饮食处理0周时（即小鼠6周龄）,虽然在显微镜下看不到AS病变,但CCL5和CCR5在动脉壁细胞中已经开始表达,并主要定位于动脉壁中膜的平滑肌细胞当中,而内皮细胞几乎不表达。饮食处理4周后,CCL5在动脉壁以及AS早期病变部位表达显著升高,且定位于AS病变部位的巨噬细胞和平滑肌细胞当中,内皮细胞同样不表达。在饮食处理12周时,伴随着AS病变的进一步加重,病变斑块面积不断增大,CCR5蛋白表达量也显著增加,并且主要定位于AS病变斑块内的巨噬细胞和平滑肌细胞当中,内皮细胞中几乎没有表达。综上所述,本实验揭示了CCR3、CCR5及其配体在AS发生发展过程中的表达变化规律和可能的作用机制。结果显示,随着AS病变的发展,趋化因子受体CCR3、CCR5及其配体趋化因子CCL3、CCL4和CCL11的表达均显著上调,说明这些趋化因子在AS病变部位的高表达可趋化、募集更多的表达有相应趋化因子受体（如CCR3、CCR5）的炎性细胞并发生迁移、浸润,参与AS斑块的形成,进一步加重AS病变的程度。另外,在AS病变早期,CCL5和CCL26的表达显著升高,说明其在AS发病早期起主要作用。并且,血管壁中膜的平滑肌细胞是CCL5的主要来源,CCL5的高表达可趋化多种炎性细胞到血管壁,并迁移到病变部位,介导AS早期的病理过程。随着AS病变的发展,CCR5蛋白表达量显著升高,且主要来源于病变处内膜中的巨噬细胞和位于管壁中膜的平滑肌细胞,高表达的CCR5不仅参与CCL5引起的炎性细胞的趋化作用,更重要的是参与激活迁移到病灶部位的炎性细胞和血管细胞,从而介导AS的进一步发展。