副溶血弧菌的分子检测与基因分型研究

论文摘要

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytcus)是一种嗜盐性的革兰氏阴性菌,广泛分布于海洋等盐浓度相对较高的环境中,各种海产品及水产品是其感染的主要对象,人们在误食了副溶血弧菌感染的食物后,会引起急性肠胃炎,出现腹泻,呕吐,腹部痉挛等症状甚至死亡。在世界范围内,包括中国、日本在内的很多亚洲国家,欧洲以及美国,经常发生由于食用了副溶血弧菌感染的海鲜之后引起的食物中毒事件,因此副溶血弧菌被认为是在世界范围内食用海产品引起的人类肠胃疾病的主要病因。研究认为直接耐热溶血素(TDH)和相对耐热溶血素(TRH)是副溶血弧菌最重要的两个致病因子,分别由tdh和trh基因编码,并能够作为区分致病性与非致病性副溶血弧菌的标志。从环境或海产品中分离得到的副溶血弧菌多为非致病性,而临床分离的副溶血弧菌90%以上能够分泌TDH,具有致病性。目前对副溶血弧菌的研究主要涉及副溶血弧菌的生理生化分离鉴定、分子手段的快速检测、不同来源以及不同表型副溶血弧菌的分子多态性分析、毒力蛋白的表达与结构分析等方面。我国有3.2万公里的海岸线,海产品在我国东南沿海地区十分盛行,特别是江浙一带地区海产品以其味美而深受消费者的喜爱,但是由副溶血弧菌而引起的海产品中毒的报道也屡见不鲜。因此对副溶血弧菌的快速、准确地检测对预防该菌在食物源中的污染具有重要意义,本实验旨在对2006年浙江地区不同来源的副溶血弧菌携带毒力基因的特征进行分析,并利用RAPD技术对这些副溶血弧菌进行基因分型的研究,从而为建立副溶血弧菌的基因指纹图谱奠定一定的基础,同时又发展了快速检测副溶血弧菌的新方法,为副溶血弧菌感染的监控和防治提供技术平台。1、用PCR法对2006年浙江省临床和海产品中分离得到的副溶血弧菌进行毒力基因tdh和trh的检测。结果表明,临床病人中分离到的副溶血弧菌中tdh基因的携带率为92.31%,trh基因的携带率为1.54%,91.54%为tdh阳性、trh阴性菌;海产品中分离得到的副溶血弧菌tdh基因的携带率为1.11%,trh基因的携带率为2.22%,96.67%是tdh阴性、trh阴性菌,说明引起浙江地区食物中毒的副溶血弧菌主要是tdh阳性菌,而携带trh基因的副溶血弧菌可能是一个潜在的致病原。2、利用RAPD技术对所有临床分离的副溶血弧菌和部分海产品中分离的副溶血弧菌进行基因分型。通过RAPD条件的优化,筛选到四条能够获得清晰DNA扩增条带的随机引物,在175个副溶血弧菌中共产生53个RAPD位点,其中多态性位点45个。聚类分析显示,四个不同来源的副溶血弧菌具有较高相似性系数,其中杭州中医院和邵逸夫医院聚为一类,再和绍兴人民医院聚为一类,最后再和海产品聚为一类。个体分析的结果表明,临床分离的副溶血弧菌多聚为一类,遗传相似性较高,而海产品分离的副溶血弧菌多态性更为丰富,175个副溶血弧菌被分为43个组,其中A组包括了74.6%的临床菌株,Ⅰ组包括了52.1%的海产品分菌株,而40%的海产品分离株各自独立为一组。91.1%血清型为O3的副溶血弧菌属于A组,并且该组所有的菌株都为tdh阳性,trh阴性菌,进一步说明引起食物中毒的副溶血弧菌主要是tdh阳性菌,并且表明血清型为O3的副溶血弧菌更容易引起感染。3、为了发展快速、准确的副溶血弧菌分子鉴定技术,以RAPD实验结果为基础,设计了新的检测引物,研究了快速检测副溶血弧菌的PCR技术和基于SYBR GreenⅠ为荧光染料的定量PCR技术。该类方法对副溶血弧菌均具有很好的特异性,其它弧菌和非弧菌类微生物都没有产生特异性扩增条带,其中PCR检测的最低检出限为5 pg;荧光定量PCR检测的最低检出限为50fg纯DNA和10~2CFU纯培养物,比传统PCR具有更低的检出限,为一可靠的新的分子检测技术,为以后海产品中副溶血弧菌的检测应用提供了良好的技术平台。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 副溶血弧菌的研究概况
• 1.1.1 副溶血弧菌的生化特性
• 1.1.2 副溶血弧菌的致病因子
• 1.1.2.1 溶血素
• 1.1.2.2 尿素酶
• 1.1.2.3 其它致病因子（蛋白酶）
• 1.1.3 小结
• 1.2 副溶血弧菌检测技术的研究进展
• 1.2.1 最大可能数法（MPN）
• 1.2.2 聚合酶链式反应（PCR）
• 1.2.2.1 常规 PCR
• 1.2.2.2 多重 PCR
• 1.2.2.3 Real-time PCR
• 1.2.3 DNA杂交
• 1.2.4 显色培养基
• 1.2.5 小结
• 1.3 副溶血弧菌基因分型技术的研究进展
• 1.3.1 随机扩增多态性分析
• 1.3.2 脉冲场凝胶电泳分析
• 1.3.3 限制性片断长度多态性分析
• 1.3.4 核糖体分型
• 1.3.5 小结
• 1.4 课题的研究意义
• 1.4.1 预防副溶血弧菌的感染
• 1.4.2 为副溶血弧菌的分子流行病学研究打下基础
• 第2章 副溶血弧菌毒力基因tdh和trh的PCR检测
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 菌种及其来源
• 2.2.1.2 试剂
• 2.2.1.3 培养基
• 2.2.1.4 重要仪器设备
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 副溶血弧菌的活化
• 2.2.2.2 菌种保存
• 2.2.2.3 副溶血弧菌毒力基因tdh和trh的检测
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 副溶血弧菌菌基因组DNA的提取
• 2.3.2 毒力基因tdh和trh的PCR扩增
• 2.3.3 结果分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 PCR扩增条件的优化
• 2.4.2 毒力基因tdh和trh的携带特征
• 2.5 本章小结
• 第3章 副溶血弧菌RAPD的基因分型研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 菌种及其来源
• 3.2.2.2 试剂
• 3.2.2.3 培养基
• 3.2.2.4 重要仪器设备
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 菌种活化
• 3.2.2.2 基因组DNA的提取和浓度的测定
• 3.2.2.3 RAPD-PCR扩增
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 基因组DNA的提取
• 3.3.2 RAPD反应体系的优化
• 3.3.3 引物的筛选
• 3.3.4 RAPD扩增结果
• 3.3.5 数据分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 RAPD标记的重复性
• 3.4.2 不同来源副溶血弧菌菌群的分析
• 3.3.3 致病性与非致病性副溶血弧菌的特异性分子标记
• 3.4 本章小结
• 第4章 一种新的检测副溶血弧菌PCR方法的建立
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.1.1 菌种及其来源
• 4.2.1.2 试剂
• 4.2.1.3 重要仪器设备
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 RAPD-PCR扩增
• 4.2.2.2 RAPD条带的割胶纯化
• 4.2.2.3 PCR产物目的片断的克隆测序
• 4.2.2.4 引物设计
• 4.2.2.5 副溶血弧菌的PCR检测
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 RAPD-PCR扩增
• 4.3.2 测序结果和引物设计
• 4.3.3 PCR扩增结果
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第5章 副溶血弧菌的荧光定量 PCR检测
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.1.1 菌株及其来源
• 5.2.1.2 试剂
• 5.2.1.3 培养基
• 5.2.1.4 重要仪器设备
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.2.1 菌种活化
• 5.2.2.2 基因组DNA的提取
• 5.2.2.3 Real-time PCR
• 5.2.2.4 水产品中副溶血弧菌的检测
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 引物设计
• 5.3.2 引物的特异性检测
• 5.3.3 标准曲线的绘制
• 5.3.4 水产品中副溶血弧菌的检测
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第6章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢