论文摘要
目的促进血管形成是当今国内外治疗缺血性疾病研究的热点之一,而血管内皮细胞增殖、分化可导致毛细血管生成。血管内皮细胞生长因子（VEGF）是一种能刺激内皮细胞增殖,增加内皮通透性的血管源性蛋白。大量研究已证实VEGF是刺激血管形成最关键的生长因子。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有自我更新,克隆非造血组织的前体,并且具有分化骨细胞,软骨细胞,骨骼肌细胞,等多种细胞的功能。而且在体内及体外被基因转染的MSCs可以保持稳定性。丝/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase Akt）,又名为蛋白激酶B（protein kinase B, PKB）是生物信号传递途径中的重要因子,并与磷脂酰肌醇-3-羟基激酶（phophatidylinostitol-3-kinase, PI3K）构成重要的PI3K/Akt信号传导通路,在血管生成过程中伴有重要的作用。曾有研究证实MSCs中过量表达Akt可以抑制细胞凋亡,促进细胞存活,而且少量的Akt就有作用。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）从能发光的生物水母（Aequorea Victoria）中分离出来现已被广泛应用于示踪活细胞内基因的表达,已经成为细胞与分子生物学研究的一种流行的实验工具。本试验：1、克隆构建GFP/Akt表达载体及鉴定,MSCs的分离培养及鉴定；2、通过脂质体真核细胞转染法,荧光显微镜下观察GFP/Akt表达载体在鼠MSCs中的表达和定位及其对VEGFmRNA和蛋白表达的影响；3、转染GFP/Akt的MSCs对下肢缺血大鼠血管生成的影响。材料与方法一、材料Wistar大鼠[SCXK（辽）2003-0009],4周-6周、体重150-200g（购自中国医科大学动物试验中心）。二、方法1、克隆构建GFP/Akt表达载体及鉴定：GFP-Akt primer设计F 5’-CGAGGAATTCGATGAACGACGTAGCCATTGT-3’（含EcoRⅠ位点）R 5’-TATCAGGATCCACCTCAGGCTGTGCCACTGG-3’（含BamHI位点）。Akt基因PCR扩增：以pcDNA3-Akt为模板PCR扩增此基因的开放阅读框架,引物上游引入EcoRⅠ酶切位点,下游引入BamHI酶切位点。反应体系如下：DW 72.5ul,10×pyrobest buffer泳100 u1。反应条件：94℃3min,94℃50s,60℃lmin,72℃3min,72℃10min, 4℃store,30 cycles。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证,在约1400bp处有明显条带,将其回收。酶切,连接,转化,质粒提取,过夜培养,次日小量提取质粒,同时保存菌种。pCDNA-Akt片断扩增鉴定：Rt-PCR产物进行1%琼脂糖电泳验证,在约1450bp处为一单一条带,跟目的片段大小位置一致重组质粒酶切鉴定：取2ul质粒进行双酶切鉴定。经1%琼脂糖电泳验证,6个菌落经鉴定正确,在约4700bp处有GFP载体的酶切片段,1450bp处有Akt的酶切片段。次日大量提取质粒。浓度检测：根据0D值GFP浓度是0.85ug/ul, GFP-Akt浓度是1.874ug/ul。2、MSCs分离培养及鉴定：将Wistar大鼠（4周-6周、体重150-200g）,颈椎脱臼处死,75%酒精浸泡1分钟消毒,无菌条件下取出股骨及胫骨,剪去骨两端,用6ml肝素化（100u/ml）PBS （PH7.40）冲洗骨髓腔,将冲洗液缓缓加于Percoll（比重1.074g/ml和1.070g/ml）分离液上梯度离心（500g,20mins）后,吸取界面层细胞,用10mlPBS将其吹打制成细胞悬液洗涤（100g,10min）后弃上清,共两次。用含15%FBS的L-DMEM培养液10ml将获得的细胞吹打制成悬液接种于25cm2塑料培养瓶中,在37℃、5%CO2条件下于孵育箱中培养,3天后半量换液以后每隔2-3d全量换液以弃除悬浮,以后培养和传代按细胞培养常规。3、脂质体真核细胞转染：取第二代细胞（Passage 2, P2）1.0-2.0×104传至24孔板上,待细胞长至80%-90%融合,分对照组、转染GFP组和转染GFP-Akt组三组（每组8孔）,按Lipofectamine TM2000转染试剂说明方法,次日全部换液;对照组换含15%FBS的L-DMEM,转染GFP组及转染GFP-Akt组换含加入G418（400ug/ul）的15%FBS的L-DMEM,三天换液一次,维持筛选作用。两周后,转染细胞单克隆形成,其间荧光显微镜观察稳定转染效率并照相（取同一视野倒置相差显微镜和荧光显微镜观察转染效率：GFP组转染率为7.64%、GFP-Akt组转染率为6.5%）。4、实验大鼠分组,双下肢缺血大鼠模型的制备及处理Wistar大鼠30只,鼠龄8-10周,体重150-250g；动物随机分为3组：基因治疗组,非基因治疗组,对照组。大鼠用1%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射麻醉,自其腹股沟韧带中点到膝关节上做一纵型切口,分别离断双侧的股动脉及其分支。基因治疗组、非基因治疗组、对照组左侧内收肌,腓肠肌取7个点分别共肌注1.0×107 pEGFP-C1/AKT转染的MSCs,1.0×107MSCs, PBS;右侧分别肌注PBS、PBS.生理盐水做对照。5、动脉照影：实验动物分别于术后第4周在DSA下肢动脉造影,穿刺腹主动脉推注70%泛影葡胺连续摄片,对照观察双下肢血管分布密度。6、毛细血管密度的测定：处死动物分别取其左侧的内收肌和半膜肌标本,以10%的甲醛固定,兔抗人F-Ⅷ及CD34抗体染血管内皮细胞,苏木素复染,中性树胶封片。光镜观察血管内皮细胞呈棕黄色。每个标本随机取10个视野,在高倍镜（400倍）下观察,计算毛细血管密度（毛细血管数／高倍镜）。7、RT-PCR检测AKTmRNA的表达：（1）分别取1.0×107细胞用RNA提取试剂Trizol提取总RNA。紫外分光光度计测样品浓度,琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,用MMLV第一链CDNA合成试剂盒反转录合成CDNA,按说明书操作。取反转录产物4ul进行PCR反应：95℃预变性2 min94℃变性lmin55℃复性lmin72℃延伸lmin,32个循环72℃延伸lmin,32个循环,72℃延伸10min内对照p-actin（上游5′-GCCAACCGTGAAAAGATG-3’,下游5′-CCAGGAT-AGAGCCACCAAT-3’）扩增长度681bp（退火温度57℃,循环30次）;VEGF（上游5’-GCCTTGCCTTGCTGCTCTA-3’,下游5′-TAACTCAAGCTGCCTCGCC-3’）扩增长度505bp（退火温度55℃,循环30次）：Akt（上游5′-GAGGAGCGGGAAGAGTG-3’,下游5′-GAGACAGGTGGAAGAAGAGC-3’）扩增长度672bp（退火温度54℃,循环30次）。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色显色,凝胶图像分析系统分析,以Akt mRNA和VEGFmRNA分别与β-actin mRNA灰度比值作为Akt mRNA及VEGF mRNA半定量指标。（2）取约100mg组织,Trizole液提取总RNA总RNA提取操作均按说明书进行。紫外分光光度计（A260/A280）检测RNA纯度。逆转录反应：总RNA 1μl,Oligo dT-Adaptor primer 1μl,70℃5min,水浴2 min,按顺序加入10×RNAPCR缓冲液2μl、10 mmol/L Dntp mixture 2μl、RNA酶抑制剂20 U、反转录酶1 ul等,加去离子水至20μl。30℃10 min,50℃30 min,99℃5 min,5℃5 min,水浴1-2 min。逆转录合成的cDNA在-20℃保存用于PCR,以下操作同上8、Western blot法：（1）分别取1.0×107细胞,细胞裂解液裂解细胞,蛋白抽提上样,进行10%SDS-PAGF电泳,半干法电转移法100V恒压电泳1.5h将蛋白转印到PVDF膜上。室温下用TBS阻断1h；5%脱脂奶粉封闭1h后加一抗（工作浓度1：400）,37℃,2h,洗膜；加入二抗（生物素化山羊抗兔IgG抗体,工作浓度1：400）,37℃,2h,洗膜；DAB显色,照相。Western blot条带图像存入计算机,用Quantity One图像分析软件包进行光密度计算。（2）剪碎约100mg内收肌组织,机械匀浆,离心10 min。考马斯亮蓝R250染色法测总蛋白质浓度,将各组浓度调到同一水平以下操作同上。三、统计学处理：应用SPSS 12.0统计软件包进行数据处理,不同组间分析采用方差分析（ANOVA）检验,有显著意义后用最小有意义差异t检验进行均数间的多重比较,检验水准α=0.05。结果一、MSCs的分离、培养及鉴定：MSCs培养5-7 d长满瓶底,此时,细胞呈平行或漩涡状生长,多次传代融合生长时,有更均匀有序的成纤维细胞样分布。CD2、CD44和CD71免疫细胞化学染色均可见棕黄色颗粒沉积于胞膜,而CD34免疫细胞化学染色后未见棕黄色颗粒沉积于胞膜。二、重组质粒的鉴定和转染：pEGFP-C1/Akt重组质粒酶切片段分别显现在4700bp和1450bp处,与扩增的pEGFP-C1和Akt目的片断相符。三、GFP/AKT组、GFP组转染MSCs后AKTmRNA及蛋白与VEGFmRNA及蛋白的相关性：GFP/AKT组、GFP组转染MSCs后VEGF蛋白和Akt蛋白表达显著正相关,VEGF mRNA和Akt mRNA表达亦正相关。四、转染GFP/AKT的MSCs、MSCs对下肢缺血大鼠血管生成的相关性：移植后第28 d腹主动脉造影显示,基因治疗组结扎股动脉处的远端毛细血管生成较明显,血管成网状,优于非基因治疗组及对照组。结论一.MSCs分离、培养成功。二.GFP/AKT重组质粒的构建、转染成功。三、转染GFP/AKT的MSCs组AKTmRNA及蛋白与VEGFmRNA及蛋白高于转染GFP的MSCs组。四、转染GFP/AKT的MSCs组对下肢缺血大鼠的血管生成高于MSCs组。
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