发夹型DNA荧光探针设计新方法研究

论文摘要

随着第一台核酸合成仪的诞生和DNA化学合成、标记技术取得的重大突破,核酸分子探针的应用得到了飞速发展。由于核酸探针设计简单、稳定性好、易于合成、信号转导机制灵活,因而被广泛的应用到化学、医学和生物学等领域。至今,核酸探针已经发展出许多类型,如经典的RNA探针、cDNA探针及基因组DNA探针等,新型的阴阳探针、TaqMan探针、Padlock探针、核酸识体（aptamer）探针、分子信标探针等。自从Tyagi和Krammer于1996年发明分子信标探针以来,发夹型的核酸探针作为一种高选择性和高灵敏性的新型荧光探针得到了广泛的应用。随着对发夹型核酸探针研究的深入及新型发夹型核酸探针的出现,人们发现发夹型核酸探针不仅适用于体外蛋白质和核酸的分析,同样也适用于活体分析。它还可以用于核酸与药物小分子、蛋白质等相互作用的研究,是一种极好的研究核酸与蛋白质相互作用的工具,也是一种极具发展前景的新型核酸探针。发夹型核酸探针与传统的核酸探针相比,能很好的分辨单碱基错配,且能用于实时监测。核酸探针的标记物有生物素、放射性物质和荧光基团等。其中,荧光分子标记由于对生物分子影响较小、灵敏度高、且分析检测手段简单,成为最常用的标记物。本论文着眼于发夹型DNA荧光探针新方法的研究,主要开展以下三个方面的工作:（1）基于时间分辨荧光技术,设计了一种利用铕离子配合物作为荧光基团的发夹型荧光探针。由于铕离子配合物的荧光寿命长,用于生物样品检测时能有效消除背景荧光,提高了探针检测的灵敏度。（2）基于汞离子与DNA的T碱基的特异性结合作用和荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）,设计了以T-Hg2+-T结构为茎部的发夹型DNA荧光探针,并用此DNA荧光探针实现了生物硫的高灵敏度检测。（3）基于一些杂环荧光小分子能与DNA缺失位点中的碱基形成氢键结合的特性,设计了一种免标记发夹型荧光核酸探针,考察了这种核酸探针的实验条件,并对其合理性进行了验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 荧光核酸探针
• 1.1.1 TaqMan 探针
• 1.1.2 阴阳探针
• 1.1.3 相邻探针
• 1.1.4 核酸适体荧光探针
• 1.2 发夹型核酸探针
• 1.2.1 Break light 探针
• 1.2.2 LUX 探针
• 1.2.3 分子信标
• 1.3 本论文的选题依据及研究内容
• 3+长寿命的发夹型荧光核酸探针设计'>第2章 基于Eu³⁺长寿命的发夹型荧光核酸探针设计
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 主要仪器和试剂
• 2.2.2 DNA 杂交分析
• 2.2.3 荧光寿命的测量
• 2.2.4 荧光量子产率的确定
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 铕离子配体的结构和光谱特性
• 2.3.2 探针的设计和特性
• 2.3.3 稳态荧光检测DNA 杂交
• 2.3.4 细胞介质中的核酸检测
• 2.4 小结
• 第3章 基于金属配位作用的生物硫发夹型荧光核酸探针设计
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂和仪器
• 3.2.2 光谱测量
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 实验原理
• 3.3.2 金属离子与P2 的作用
• 3.3.3 实验条件优化
• 3.3.4 灵敏度检测
• 3.3.5 选择性检测
• 3.4 小结
• 第4章 基于缺失位点的发夹型荧光核酸探针设计
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 主要仪器和试剂
• 4.2.2 光谱测量
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 实验原理
• 4.3.2 实验可行性研究
• 4.3.3 温度影响
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢