膜—细胞骨架联接分子ezrin对肝细胞肝癌生长和转移的影响

论文摘要

早期复发和转移是导致肝癌预后不良的重要原因之一。在我们前期的研究中发现阻断HGF-c-met信号通路对抑制肝癌的复发转移有着重要的意义。但SF／HGF-c-met所介导的信号转导又参与多种细胞的增殖与分化，完全封闭该通路可能会影响正常细胞的正常生长分化及功能。因此，进一步研究该通路下游传导，寻找新的治疗靶点对有效且特异性治疗肿瘤复发转移有着非常重要的意义。膜-细胞骨架联接蛋白ezrin是HGF／c-met信号通路的下游分子之一，也是细胞骨架蛋白的重要调节分子。细胞骨架的改变在细胞转化和癌变过程中是非常普遍的现象，很多原癌基因激活后都会引起转化细胞肌动蛋白丝的破坏和局部粘附性下降等变化。本研究首先检测了ezrin在不同转移潜能肝癌细胞系和肝癌组织中的表达差异，然后通过RNA干扰技术下调具不同肝癌细胞系中ezrin的表达，通过体内体外实验观察ezrin对肝癌细胞增生、迁移和侵袭能力的影响。为肝细胞癌复发和转移的治疗提供实验基础和理论依据。一、ezrin在不同转移潜能肝癌细胞系和不同分化程度肝癌组织中的表达差异目的：检测膜—细胞骨架联接蛋白ezrin与胞浆型细胞骨架蛋白β-actin和γ-actin在高低转移潜能肝癌细胞细胞系及ezrin在不同分化程度的肝癌组织中的表达差异，探讨ezrin在肝癌生长和转移过程中的作用。方法：分别应用免疫荧光、RT-PCR和Western-blot检测ezrin和骨架蛋白在不同转移潜能肝癌细胞系中的表达。然后通过组织芯片技术比较分析正常肝，肝硬化和不同分化程度的肝细胞癌组织内ezrin基因表达差异。结果：免疫荧光显示ezrin和骨架蛋白表达于胞浆，且双色荧光证实两者存在共表达；高转移潜能细胞系SF／SMMC7721，MHCC-1和MHCC97-H中ezrin和骨架蛋白的表达明显高于低转移潜能细胞系SMMC7721，Hep3B和HepG2（X2=13.277，P=0.010；X2=21.815，P=0.000）；RT-PCR和Western-blot显示高转移潜能细胞系ezrin和骨架蛋白γ-actin的mRNA和蛋白表达均高于低转移潜能细胞系，β-actin在高低转移潜能细胞系的表达无差异。200点肝癌组织芯片结果分析显示肝细胞癌的ezrin表达明显高于正常肝和肝硬化组织，且各个分化程度的肝癌ezrin的表达也存在差异，分化程度越低ezrin的表达越高（X2=36.52，P＜0.05）。结论：ezrin和骨架蛋白β-actin的过表达与肝癌的转移潜能相关，ezrin的过表达可能与肝癌的高转移性相关。二．RNA干扰下调ezrin表达对肝癌细胞生长和运动能力的影响目的：进一步探讨膜-细胞骨架联接蛋白ezrin对肝癌生长和运动转移能力的影响。方法：选取4株肝癌细胞系（SF／SMMC7721、MHCC97-H、MHCC-1和HepG2）作为研究对象，针对ezrin基因设计小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）并通过脂质体转染入细胞。分别通过荧光实时定量聚合酶链反应（Real-timePCR）和Western印迹验证siRNA对ezrin在基因和蛋白水平的下调及下调作用随转染时间的变化。根据Western印迹的结果选取ezrin蛋白表达最低的时间点检测干扰后肝癌细胞生物学行为的改变。运用四甲基偶氮唑兰（MTT）法检测肝癌细胞增殖能力的变化；流式细胞仪检测细胞周期；电子显微镜观察细胞伪足的形态和数量改变；transwell实验检测肝癌细胞运动和侵袭能力的变化。结果：荧光实时定量聚合酶链反应和Western印迹显示ezrin siRNA对ezrin在基因和蛋白水平均有显著的下调作用。下调ezrin蛋白可显著减慢4株肝癌细胞的生长速度（P＜0.05），处于分裂期的肝癌细胞比例明显下降。肿瘤细胞的运动侵袭能力下降，细胞伪足变短，且伪足的形成数量显著减少（SF／SMMC7721：20.8±3.0个／细胞与13.2±2.4个／细胞，P＜0.05；MHCC97-H：18.4±2.7个／细胞与14.0±2.9个／细胞，P＜0.01；MHCC-1：22.6±3.5个／细胞与13.3±1.9个／细胞，P＜0.01；HepG2：31.0±2.9个／细胞与17.8±2.3个／细胞，P＜0.01）。穿过人工基底膜的细胞数量也明显减少（SF／SMMC7721：49.9±7.7个与31.9±5.2个，P＜0.05；MHCC97-H：58.5±4.2个与33.0±3.3个，P＜0.01；MHCC-1：57.6±6.1个与28.3±3.4个，P＜0.01；HepG2：37.3±3.0个与25.3±2.3个，P＜0.01）。结论：ezrin在肝癌生长和侵袭转移过程发挥重要的作用，有可能成为抑制肝癌复发转移的关键分子。三．ezrin对肝癌生长和转移影响的体内研究目的：选取高转移潜能肝癌细胞系MHCC-97H为研究对象，通过裸鼠体内实验进一步验证ezrin对肝癌生长和转移的影响。方法：通过转染入细胞持续表达ezrin siRNA的质粒，筛选出一株ezrin下调稳定株。体外鉴定其生长和运动侵袭能力后，进行裸鼠皮下接种实验，通过绘制肿瘤生长曲线和比较ezrin下调前后肿瘤的淋巴结和肺转移率来评估ezrin对肝癌生长和转移的影响。结果：转染质粒后的MHCC-97H经过G418筛选后，选取ezrin抑制率最高的命名为97H-ezrin（L）。体外实验结果显示97H-ezrin（L）的恶性增殖能力和运动侵袭能力均明显下降（p＜0.01）。裸鼠皮下接种肿瘤后2周成瘤，97H-ezrin（L）的生长速度明显慢于MHCC-97H，到6周处死时MHCC-97H成瘤的重量是97H-ezrin（L）的1.5倍。肿瘤病理切片显示实验组97H-ezrin（L）肿瘤细胞的分裂相及病理分裂相较数量较对照组明显减少。肺和淋巴结的病理切片显示97H-ezrin（L）肿瘤肺转移率为60％（9／15），低于MHCC-97H 86.7％（13／15）：97H-ezrin（L）的淋巴结转移率为33.3％（3／9）低于MHCC-97H 70％（7／10）（P＜0.05）。结论：下调ezrin可抑制肝癌的恶性增殖和肺及淋巴结转移率，ezrin是HGF下游参与肝癌生长和转移的关键分子。四、小结本研究在细胞内运用不同方法比较了不同转移潜能肝癌细胞系和不同分化程度的肝癌组织内ezrin表达差异；并应用RNA干扰技术下调ezrin蛋白在细胞内的表达，通过比较干扰前后的生物学行为改变，证明ezrin在肝癌生长和侵袭转移过程的重要的作用。同样在体内研究中，用导入干扰RNA的质粒的细胞接种裸鼠后，其肺和淋巴结的转移率均明显降低，进一步证明了有ezrin在肝癌浸润和转移过程中的作用。提示ezrin是HGF-c-Met信号通路中的关键分子，可能成为治疗肝癌转移复发的新靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分:ezfin在不同转移潜能肝癌细胞系和不同分化程度肝癌组织中的表达差异
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分:体外RNA干扰下调ezrin表达对肝癌细胞生长和运动能力的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分:ezrin对肝癌生长和转移影响的体内研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献:
• 附录一:
• 致谢
• 附录二:
• 综述1:影响肿瘤细胞运动各相关因素的研究进展
• 综述2:膜-细胞骨架联接分子ezrin在肿瘤生长和转移中的作用
• 附录三:
• 在学期间发表论文