论文题目: 丙型肝炎病毒NS3蛋白酶及抑制肽研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 胡巍
导师: 凌世淦
关键词: 丙型肝炎病毒,蛋白酶,酵母表达,噬菌体表面展示技术,蛋白酶多肽抑制剂
文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院
发表年度: 2005
论文摘要: 丙型肝炎是人类最常见的慢性传染性疾病之一,丙型肝炎病毒(HCV)是丙型肝炎的致病原。目前还没有有效地预防和根治此病的方法。HCVNS3是病毒基因组编码的非结构蛋白,具有多种功能。其氨基端的NS3蛋白酶(1-180aa)是有效抑制病毒复制的重要靶点。本研究利用蛋白重组技术和噬菌体表面展示技术,设计表达和筛选具有抑制HCVNS3蛋白酶活性的抑制多肽,为特异性抗HCV的多肽药物研究奠定基础。 方法:(1) 用原核表达载体pQE-30分别构建含有NS3蛋白酶基因的pQE/NS3和含有单链NS3/4A基因的pQE/NS3/4A重组质粒;用重组质粒转化大肠杆菌M15,化学诱导表达目的蛋白并采用离子交换层析纯化蛋白。(2) 用酵母转化载体pPICZαA,构建含有NS3蛋白酶基因克隆的pPICZaA/NS3和含有单链NS3/4A克隆的pPICZαA/NS3/4A重组质粒;用重组质粒电转化酵母GS115,甲醇诱导表达并分级沉淀纯化NS3蛋白酶。(3) 利用高效原核表达载体pBVIL1和基因合成的方法,构建蛋白酶催化底物NS5A-B重组表达质粒pBVIL1/NS5A-B,转化大肠杆菌HB101,热诱导表达目的蛋白,采用离子交换层析的方法纯化蛋白;在体外用融合NS5A-B蛋白底物建立蛋白酶催化系统,并用SDS-PAGE、ELISA等方法对蛋白酶活性进行测定。(4) 根据蛋白酶底物特异性,设计合成底物竞争性抑制肽基因,并构建原核重组表达载体pBVIL1/H9,表达、纯化底物竞争性抑制肽;在体外用SDS-PAGE鉴定抑制活性。(5) 利用噬菌体表面展示技术,筛选具有抑制活性的NS3蛋白酶抑制肽,并在体外系统鉴定抑制活性。 结果:(1) 测序结果证实,构建的原核表达载体pQE/NS3和pQE/NS3/4A正确,
论文目录:
缩略语索引
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 HCV NS3蛋白酶基因片段的克隆和原核表达
材料与方法
结果
讨论
小结
第二部分 HCV NS3蛋白酶在酵母表达系统中的可溶性表达
材料与方法
结果
讨论
小结
第三部分 HCV NS3蛋白酶底物的克隆表达与蛋白酶活性研究
材料与方法
结果
讨论
小结
第四部分 HCV NS3蛋白酶竞争性底物抑制多肽的表达和抑制活性研究
材料与方法
结果
讨论
小结
第五部分 HCV NS3蛋白酶抑制多肽的筛选和抑制活性研究
材料与方法
结果
讨论
小结
总结
第六部分 丙型肝炎病毒分子生物学特征及其蛋白酶抑制剂研究进展
参考文献
致谢
附录
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博士期间发表论文全文
发布时间: 2005-09-05
参考文献
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