论文摘要
罗丹明B（Rhodamine B,RB）是一种人工合成的具有鲜桃红色的三苯甲烷类碱性的染料,我国和欧盟等都不允许在食品中添加。本论文旨在建立罗丹明B的免疫检测方法。根据罗丹明B的结构,用混合酸酐法与牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）偶联,用碳二亚胺法与卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）偶联,制备出免疫原RB-BSA,包被原RB-OVA。通过紫外/可见分光光度计对合成的人工抗原进行鉴定,偶联物具备半抗原和蛋白的双重特征吸收峰,因此可以判断偶联成功。考马斯亮蓝法测得免疫原的蛋白浓度,计算其偶联率,偶联率为11.67。利用免疫原RB-BSA免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA测定效价、抑制率筛选出特异性好的多克隆抗体。所得的抗血清效价为64000。依此抗血清为基础,初步建立间接竞争ELISA方法,并通过对包被缓冲液、封闭液、抗体稀释液、样品稀释液（pH、甲醇、NaCl）等条件的优化以获得更好的结果。最终得到最佳的工作条件即包被液为pH=9.6的碳酸盐缓冲液,封闭液为含0.1%明胶的包被缓冲液,一抗稀释液为含0.1%明胶、0.05%Tween-20的磷酸缓冲液,二抗稀释液为含5%海藻糖、0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸缓冲液,标准品稀释液为添加3.6% NaCl的pH 7.4的PBS。优化后最终的到罗丹明B标准曲线。检测限0.1ng/mL,半数抑制量（IC50）为1ng/mL,线性范围为0.1～20ng/mL。包被原浓度为2μg/mL,抗体工作浓度3μg/mL,该抗体具有较强的特异性,与罗丹明6G、结晶紫、赤藓红、孔雀石绿进行交叉反应,交叉反应率均小于0.1%。罗丹明B在辣椒粉样品添加回收率为67.87-89.30%,变异系数小于15%,达到对罗丹明B残留快速检测的要求。用罗丹明B抗体建立免疫亲和柱（Immunoaffinity Chromatography, IAC）样品净化方法,并利用高效液相-质谱联用（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS）检测。对实际样品进行添加实验,回收率为65.4-95.30%。其检测效果与ELISA方法相符,由此可见罗丹明B的ELISA及IAC-LC/MS的检测方法是罗丹明B食品残留检测的有效方法,为更好的监测罗丹明B的残留提供有效的技术支持。