应用SSH技术筛选和克隆奶牛乳房炎抗性相关基因

论文题目: 应用SSH技术筛选和克隆奶牛乳房炎抗性相关基因

论文类型: 博士论文

论文专业: 临床兽医学

作者: 曹随忠

导师: 赵兴绪,杜立新

关键词: 奶牛,乳房炎抗性,抑制性消减杂交,基因表达,基因,基因,差异筛选,文库

文献来源: 甘肃农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 乳房炎是造成奶牛业损失最严重的疾病之一,尽管在许多国家都广泛地实施了乳房炎防制措施,但它仍然是世界奶牛业面临的最大威胁。研究表明,奶牛乳房炎抗性在种间和种内都存在显著的遗传差异,通过遗传选择提高乳房炎抗性可能是解决这一重大疾病最好的长期策略。由于人们目前对控制奶牛乳房炎抗性的相关基因及其分子机制等还不清楚,这就严重阻碍了人们通过治疗、免疫接种和遗传选择等途径来显著提高奶牛对乳房炎的整体抗病力。本研究旨在通过分离和克隆与奶牛乳房炎抗性相关基因的探索性研究,初步揭示参与乳房炎抗性的基因种类和数量,为进一步深入开展乳房炎抗性的分子机理研究及将来通过遗传选择提高乳房炎的抗性提供理论基础。本研究取得的主要结果如下:1.应用抑制性消减杂交(SSH)技术成功构建了患乳房炎奶牛与健康奶牛外周血白细胞差异表达cDNA文库。以经产荷斯坦奶牛外周血白细胞为材料,分离Poly(A)+ RNA,反转录合成单链及双链cDNA,经酶切成为平均大小400~600bp的片段。将患乳房炎奶牛cDNA分成两组,分别与2种不同的接头连接,再与健康奶牛cDNA进行2次消减杂交和2次抑制性PCR扩增,将第2次PCR产物纯化后与pGM-T Easy载体连接,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞进行文库扩增,最终构建得到了具有高消减效率的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库。文库扩增后得到610个白色阳性克隆,随机挑选16个克隆进行PCR鉴定,鉴定结果表明插入片段主要分布在250~750bp之间。2.应用反向Northern斑点杂交技术从消减cDNA文库中高通量筛选得到50个差异表达的克隆。分别用地高辛标记患乳房炎奶牛和健康奶牛cDNA作为杂交探针,对构建的cDNA消减文库利用反向Northern斑点杂交技术筛选了50个差异表达克隆,测序后得到48个质量合格的EST序列。根据在GenBank非冗余核酸数据库(nr)和EST数据库中BLASTn序列比对结果,将这些EST分为3类:第一类代表已知基因,共35个;第二类代表已知EST,共5个;第三类为新EST,共3个。代表已知基因的ESTs按照基因功能分为八类:信号转导与细胞间通信、细胞结构与运动、细胞凋亡、细胞与机体防御、物质转运、翻译与表达调控、代谢及其它。结合相关文献初步探讨了部分患乳房炎奶牛差异表达基因的作用和意义,其中WIP、bnbd5、AHCY、S100A12、MnSOD、SELL等基因可能在奶牛乳

论文目录:

摘要

Summary

第一章功能基因组学及蛋白质组学在奶牛乳房炎研究中的应用

1. 奶牛乳房炎研究现状

1.1 奶牛乳房炎分类

1.2 奶牛乳房炎的病原学特点

1.3 乳房炎病原菌致病机理研究进展

1.4 乳房炎的临床症状

1.5 乳房炎的诊断

1.6 乳房炎的治疗

1.7 奶牛乳房炎防制新策略

2. 功能基因组学及其在奶牛乳房炎研究中的应用

2.1 功能基因组学主要研究技术概述

2.2 奶牛乳房炎相关的功能基因组学研究

3. 蛋白质组学及其在奶牛乳房炎研究中的应用

3.1 蛋白质组学概念

3.2 蛋白质组学研究技术

3.3 白细胞蛋白质组学

3.4 病原微生物蛋白质组学

3.5 蛋白质组学在奶牛乳房炎研究中的应用

4. 抑制性消减杂交技术在分离差异表达基因中的应用

4.1 抑制性消减杂交技术原理

4.2 SSH 主要技术流程

4.3 SSH 技术操作要点

4.4 SSH 技术评价

4.5 SSH 技术的应用

5. 新基因的电子克隆

5.1 电子克隆概念与基本过程

5.2 利用Unigene 数据库进行电子克隆

5.3 电子克隆的应用

6. 基因差异表达及其生物学意义

7. 影响奶牛乳房炎抗性的遗传因素与乳房炎抗病育种

7.1 与乳房炎有关的抗性性状

7.2 乳房炎抗性相关QTLs 定位

7.3 乳房炎抗性候选基因

8. PMN 凋亡与奶牛乳房炎抗性

8.1 细胞凋亡的概念

8.2 PMN 凋亡的作用

8.3 PMN 凋亡的分子调控

第二章抑制性消减杂交构建奶牛乳房炎抗性相关cDNA 文库

1. 前言

2. 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

3. 结果

3.1 白细胞中总RNA 提取、mRNA 纯化及检测

3.2 双链cDNA(dscDNA)合成与酶切

3.3 接头连接效率检测

3.4 消减产物第二次PCR 结果

3.5 消减效率检测

3.6 消减文库中插入片段的PCR 鉴定

4. 讨论

4.1 奶牛乳房炎抗性相关消减cDNA 文库质量评价

4.2 消减cDNA 文库在分离疾病抗性相关基因中具有明显的优势

4.3 本研究的特色与意义

第三章反向Northern 斑点杂交差异筛选奶牛乳房炎抗性相关基因

1. 前言

2. 材料与方法

2.1 主要试剂

2.2 主要仪器设备

2.3 杂交所用溶液配制

2.4 差异筛选探针的标记

2.5 探针标记效率检测

2.6 插入片段的扩增与点膜

2.7 反向Northern 斑点杂交与显色

2.8 差异表达克隆选取

2.9 测序

2.10 差异表达EST 生物信息学分析

3. 结果

3.1 探针标记效率检测结果

3.2 反向Northern 斑点杂交筛选结果

3.3 患乳房炎奶牛和健康奶牛白细胞差异表达基因生物信息学分析

4. 讨论

4.1 β-防御素基因(β-Defensin Genes)

4.2 钙粒蛋白C 基因(S100A12 基因)(calgranulin C gene)

4.3 IκBα基因(NF kappa B inhibitor alpha)和BI-1 基因

4.4 L-选择素等细胞黏附分子基因

4.5 AHCY(S-腺苷高半胱氨酸水解酶编码基因)

4.6 WIP(Wiskott-Aldrich syndrome protein interacting protein)

4.7 MIP-3(Macrophage inflammatory protein 3)基因与IgJ 基因

4.8 其它

第四章两个新基因cDNA 片段的电子克隆与序列分析

1. 前言

2. 试验材料和方法

2.1 试验材料

2.2 方法

3.结果

3.1 RT-PCR 扩增和克隆结果

3.2 测序结果及分析

3.3 EST 数据库检索结果和意义

3.4 nr 数据库检索结果和意义

3.5 氨基酸的多序列比对

3.6 利用 UniGene 数据库进行新基因的电子表达谱分析

4. 讨论

4.1 锌指蛋白基因表达调控功能与疾病发生

4.2 泛素-蛋白酶体途径与机体免疫功能

结论

致谢

参考文献

附录

作者简介

导师简介

发布时间: 2007-03-12

参考文献

[1].奶牛乳房炎性金葡菌毒力基因和耐药性及其与SCVs致病力差异[D]. 张立梅.中国农业大学2018
[2].华北地区奶牛乳房炎无乳链球菌的生物学特性及其亚单位疫苗的研究[D]. 杜琳.内蒙古农业大学2016
[3].治疗奶牛乳房炎蒙药复方的筛选及其抗炎免疫机理的研究[D]. 战永波.内蒙古农业大学2010
[4].BoLA基因多态性及其与奶牛乳房炎的关联研究[D]. 高树新.内蒙古农业大学2005
[5].治疗奶牛乳房炎的复方中药制剂的开发研究[D]. 李成应.内蒙古农业大学2008
[6].奶牛乳房炎源性浅绿气球菌的表型、基因型和致病机制研究[D]. 刘钢.中国农业大学2017
[7].甘草总黄酮抗金黄色葡萄球菌作用及其治疗奶牛乳房炎的应用研究[D]. 吴金梅.吉林大学2012
[8].奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的研究[D]. 范鑫.内蒙古农业大学2011
[9].奶牛乳房炎与肠道菌群的关联研究[D]. 马晨.内蒙古农业大学2016
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应用SSH技术筛选和克隆奶牛乳房炎抗性相关基因

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