逆境应答基因OsHSP81和OsCaMBP的克隆与分析

论文摘要

干旱、低温和土壤盐渍化等逆境胁迫将严重影响作物的生长和发育,降低产量。为了保障粮食安全,改善和提高作物对环境胁迫的抗性一直是农业生产的主要目标之一。随着植物分子生物学的发展,发掘与抗逆相关的新基因,将对耐逆作物品种的选育开辟新的途径。水稻作为最主要的作物之一,提高其抗逆能力将对粮食稳产具有重要的意义。在改善水稻的抗逆方面,定向的基因调控技术具有非常广阔的发展前景。近十年来已经有许多抗逆相关基因被转入水稻中,并获得了一些提高抗逆性的转基因植株。但是,水稻中仍然有许多未知抗逆基因没有被发现和利用。因此,本文将运用分子生物学技术,期望从水稻中找到在抗逆过程中具有重要意义的共调节因子,拟通过基因调节技术最终提高水稻的抗逆能力。为此,本文主要进行了以下三个方面的研究:1.利用荧光差异显示技术克隆逆境（低温）相关基因本实验采用mRNA荧光差异显示（Fluorescence Differential Display,FDD）技术,结合大矩阵筛选,对水稻抗低温的差异片段进行了大规模的分离筛选。获得了954个低温条件下的差异表达片段。其中,受低温特异诱导表达的片段200余个,在低温下表达增加的片段300余个,表达降低的片段400余个。通过亚克隆技术及测序分析,我们从中选取了2个在逆境条件下发生选择性剪接现象的基因进行了分析。通过半定量RT-PCR技术、蛋白质功能分析、蛋白质相互作用等技术,进一步探讨了这两个基因在水稻抗逆中的功能。2.水稻选择性剪接基因OsHSP81的功能研究（1）利用RT-PCR技术,我们克隆到了一个具有HSP90家族典型结构的新基因。该基因cDNA全长3395bp,包含919bp的5′端非编码区,376bp的3′端非编码区和2100bp的开放阅读框,推测编码一个699个氨基酸的蛋白质,其预测分子量是80.2kD,等电点为4.85,命名为OsHSP81。在克隆OsHSP81基因时还发现了它在转录过程中出现选择性剪接现象,产生了另一个转录文本OsHSP81-S。OsHSP81-S与OsHSP81位于同一基因座位上,只是ATPase功能域完全缺失。（2）利用半定量RT-PCR方法对OsHSP81和OsHSP81-S在低温、高温、干旱、高盐和激素等胁迫下进行表达分析,发现OsHSP81和OsHSP81-S在未经逆境胁迫处理时,均出现不同程度的表达;在低温、干旱、GA3和ABA胁迫下,OsHSP81和OsHSP81-S的表达量都是由降低到升高;高温、高盐和IAA胁迫下,OsHSP81表达量由升高到降低,而OsHSP81-S在这三种胁迫下,其表达量变化不显著,基本维持在一个相对稳定的表达水平下。此外,研究还发现OsHSP81和OsHSP81-S在相同逆境胁迫不同时间段存在着表达量差异。（3）使用GST融合蛋白技术,在大肠杆菌中诱导出OsHSP81和OsHSP81-S两种融合蛋白。融合蛋白经过纯化定量后进行ATPase酶活性分析,结果表明OsHSP81具有比较高的ATPase酶活性,而OsHSP81-S蛋白由于ATPase功能域的缺失不具有ATPase酶活性。同时,HSP90特异抑制物格尔德霉素（geldanamycin）的加入明显抑制了OsHSP81的ATPase酶活性,进一步证实了OsHSP81具有ATPase酶活性。（4）从酵母双杂交（Y2H）实验中筛选出与OsHSP81相互作用的蛋白OsPRP1、RBB13-3、P450,以及含ZIM domain的未知蛋白和一些水稻未知基因。其中OsHSP81和OsHSP81-S均与OsPRP1相互作用,可以确定OsPRP1与HSP81结合的部位不在ATPase酶活性区。另外,在AD和BD载体互换验证实验中,分别把OsPRP1的部分和全长序列构建到BD载体中,结果显示OsPRP1的PRR中间区域与OsHSP81和OsHSP 81-S的C端相结合。3.水稻选择性剪接基因OsCaMBP在不同逆境下的表达分析（1）经RT-PCR扩增后测序得到2094 bp的cDNA序列。该序列的编码区位于115 bp到1824 bp,编码569个氨基酸残基,预测分子量为63.2 kD。第133～162氨基酸构成IQ基序,140～150氨基酸为典型的IQ钙调素结合基序,属于钙不依赖型钙调素结合蛋白。因此,将此基因编码的氨基酸命名为水稻钙调素结合蛋白OsCaMBP。同时,在热激和低温处理时,OsCaMBP还发现了选择性剪接现象。（2）通过半定量RT-PCR方法对OsCaMBP在低温和高温胁迫下表达进行分析,OsCaMBP均不同程度地受到低温和高温诱导。在低温胁迫处理时,30 min-4 h期间OsCaMBP开始表达并逐步上升,在8 h出现表达高峰后表达量相对稳定;而在高温胁迫处理时,叶鞘在15 min即出现表达高峰,之后随着时间的推移表达量逐渐下降,而在根和叶中均为30 min～2 h表达量不断增加,并在2 h出现表达高峰,随后逐渐下降。OsCaMBP在逆境胁迫下具有器官表达差异。通过FDD技术,我们从水稻中筛选出了多个可能与逆境相关的基因。本文中发现的选择性剪接基因OsHSP81和OsCaMBP均已初步证实在不同逆境胁迫下其表达量发生改变。根据它们在逆境胁迫下的表现表达特性,可以推测它们在水稻抗/耐逆过程起着重要作用。在今后的工作中,我们将从多方面对它们在抗逆方面的功能进行分析,以及更加深入地研究它们在基因网路上的作用机制。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.选择性剪接研究综述
• 1.1 选择性剪接研究进展
• 1.1.1 选择性剪接的综合分析技术
• 1.1.2 选择性剪接复杂性分析
• 1.1.3 进化对选择性剪接频率的影响
• 1.1.4 选择性剪接在功能上的重要意义
• 1.1.5 基因组中的选择性剪接研究
• 1.1.6 选择性剪接网络
• 1.1.7 调控选择性剪接中的编码序列
• 1.1.8 剪接调控与人类疾病
• 1.2 选择性剪接在植物逆境基因表达调控中的研究进展
• 1.2.1 信号传导层面的选择性剪接
• 1.2.2 植物抗病基因的选择性剪接
• 1.3 结论及展望
• 2.热激蛋白90在植物中的研究
• 2.1 植物生长中的HSP90研究进展
• 2.2 HSP90与抗病性
• 2.3 HSP90在表型变异中的缓冲作用
• 2.4 结论及展望
• 3.钙调素结合蛋白在植物中的研究
• 3.1 CaMBP和CaM结合特性
• 3.2 CaMBP参与的生物学反应
• 3.2.1 植物发育
• 3.2.2 代谢调节
• 3.2.3 细胞骨架功能
• 3.2.4 激素反应
• 3.2.5 逆境胁迫反应
• 3.2.6 离子吸收
• 3.2.7 防御反应
• 3.2.8 转录调控
• 3.3 结论及展望
• 4.本研究的目的和意义
• 第二章 荧光差异显示及逆境（低温）相关基因克隆
• 1.引言
• 2.材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株和质粒
• 2.3 主要培养基
• 2.4 主要试剂
• 2.5 主要仪器设备
• 2.6 方法
• 3.结果与分析
• 3.1 RNA质量检测
• 3.2 荧光差异显示结果
• 3.3 差异片段亚克隆
• 3.4 差异片段测序及同源性分析
• 4.讨论
• 第三章 水稻选择性剪接基因OsHSP81功能分析
• 1 水稻OsHSP81基因的全长cDNA克隆
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 植物材料
• 1.2.2 菌株和质粒
• 1.2.3 主要培养基
• 1.2.4 主要试剂
• 1.2.5 主要仪器设备
• 1.2.6 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 OsHSP81基因的克隆及其推测氨基酸序列分析
• 1.3.2 OsHSP81基因选择性剪接的发现
• 1.3.3 OsHSP81-S基因选择性剪接的序列及结构分析
• 1.4 讨论
• 2 水稻OsHSP81基因在不同逆境下选择性剪接模式及表达分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器设备
• 2.2.4 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 OsHSP81选择性剪接生物信息学分析和逆转录验证
• 2.3.2 OsHSP81和OsHSP81-S不同逆境下选择性剪接诱导表达情况
• 2.4 讨论
• 3 水稻OsHSP81和OsHSP81-S融合蛋白表达及酶活性测定
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株及质粒
• 3.2.2 主要试剂及内切酶
• 3.2.3 主要仪器设备
• 3.2.4 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 融合蛋白的诱导及条件优化
• 3.3.2 融合蛋白的纯化
• 3.3.3 融合蛋白含量测定
• 3.3.4 ATPase酶活性测定
• 3.4 讨论
• 4 水稻OsHSP81和OsHSP81-S的相互作用蛋白研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株和质粒
• 4.2.2 主要培养基
• 4.2.3 主要试剂及内切酶
• 4.2.4 主要仪器设备
• 4.2.5 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 cDNA文库的构建
• 4.3.2 pGBKT7-OsHSP81和pGBKT7-OsHSP81-S重组载体的构建
• 4.3.3 pGBKT7-OsHSP81和pGBKT7-OsHSP81-S转录活性检测
• 4.3.4 酵母双杂交筛选与OsHSP81和OsHSP81-S相互作用蛋白
• 4.3.5 相互作用蛋白验证
• 4.4 讨论
• 5 水稻OsHSP81和OsHSP81-S转基因载体构建及转化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 植物材料
• 5.2.2 菌株和质粒
• 5.2.3 主要培养基
• 5.2.4 主要试剂
• 5.2.5 主要仪器设备
• 5.2.6 方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 过量表达正义及反义载体的构建
• 5.3.2 绿色荧光蛋白载体的构建
• 5.3.3 RNAi载体的构建
• 5.3.4 农杆菌法转化水稻愈伤组织及植株再生
• 5.4 讨论
• 第四章 水稻钙调素结合蛋白OsCaMBP基因的克隆及表达分析
• 1 水稻OsCaMBP基因的全长cDNA克隆
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 植物材料
• 1.2.2 菌株和质粒
• 1.2.3 主要培养基
• 1.2.4 主要试剂
• 1.2.5 主要仪器设备
• 1.2.6 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 cDNA克隆及序列分析
• 1.3.2 钙调素结合蛋白氨基酸序列相似性分析
• 1.3.3 OsCaMBP基因选择性剪接的发现
• 1.4 讨论
• 2 水稻OsCaMBP基因在不同逆境下的表达分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器设备
• 2.2.4 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 OsCaMBP在不同逆境下的表达情况
• 2.4 讨论
• 第五章 综合结论及创新之处
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 博士期间发表和待发表论文