光老化成纤维细胞分泌的细胞外基质促进HaCaT细胞增殖的分子机制研究

论文摘要

背景UVB是目光中的内源成分之一,它可穿透表皮,到达主要包含纤维细胞和ECM的真皮上层。皮肤活检提示老年人比年轻人有更多的衰老成纤维细胞。而且体外实验也发现反复的UVB辐射可导致HSFs发生UVB应激诱导的过早衰老（stress-induced prematuresenescence SIPS）。皮肤成纤维细胞（HSFs）的一个重要的功能是维持组织中ECM的稳态,反复UVB辐射可影响HSFs功能,进而改变ECM。至今仍未见UVB导致的ECM改变如何影响上皮细胞的生物学过程的相关研究,例如:存活、增殖、迁移、分化以及细胞内信号传导。目光性皮肤肿瘤的发生是从活化细胞到前肿瘤皮损,最终发展为恶性皮损。上述的生物学功能改变在肿瘤的发生和发展的过程中起重要作用。现有的几个研究揭示了衰老和肿瘤发生的关系,其中指出多种应激诱导的衰老成纤维细胞可促进前肿瘤细胞和肿瘤细胞的增殖,却不能刺激正常上皮细胞增殖。这一作用是通过分泌可溶性细胞因子、细胞外基质（ECM）和直接的细胞间相互作用。其中,ECM占到至少40%的刺激效应。连续UVB照射诱导的衰老HSFs具有和其他应激诱导的衰老成纤维细胞相似的分泌表型,特别是某些ECM成分的增加,如:某些胶元蛋白（collagens）、纤粘蛋白（fibronectin）和骨桥素（osteonectin）等。然而,UVB-SCIP成纤维细胞分泌的ECM是否具有相似的促进增殖的效应仍然未有相关研究。HaCaT细胞是人类的前肿瘤角质细胞,其获得了某些肿瘤易感性突变,但不能在体内形成实体肿瘤。因此是研究皮肤肿瘤形成的通用模式细胞。研究ECM对HaCaT的效应可更好的了解其促肿瘤机制。同时,两个已建立的模型为我们的研究提供了实验基础,其中之一是反复UVB辐射诱导人皮肤成纤维细胞（HSFs）的衰老模型;其二是HSFs生成的ECM的制备。之前的研究提示衰老的成纤维细胞分泌的ECM可促进HaCaT细胞的增殖和加速细胞进程。虽然导致这一效应的分子基础并不清楚,但现有研究提示在ECM和许多类型上皮细胞作用中ERK1/2和PI3K/AKT信号通路在其中扮演重要的存活和促增殖的角色。因此我们假设HaCaT黏附于皮肤成纤维细胞分泌的ECM可活化PI3K/AKT和MAPK家族的成员如:ERK1/2,然后观察这些信号分子的活化程度和时相性变化。在此基础上,进一步去探询相关的上游信号。其中,我们重点观察黏着斑激酶（FAK）,它是一个125kD的酪氨酸激酶（PTK）,在胞膜内侧与整合素共定位,并在整合素介导的信号传导中扮演重要的角色。在ECM和整合素受体结合后被活化,进而激活下游的PI3K/AKT和RAS-RAF-ERK1/2。在以上理论的基础上,我们假设成纤维细胞分泌的ECM可通过活化ERK和PI3K/AKT信号通路促进细胞增殖。我们的研究提供证据证实了这一假设。靶向性干预这些信号有助于预防和治疗慢性目光源性皮肤肿瘤。方法1)连续给予未衰老成纤维细胞亚细胞毒剂量（15mJ/cm2）UVB辐射5次,根据SA-βgal染色和DNA合成等指标鉴定成纤维细胞是否发生衰老。将衰老和未衰老的成纤维细胞接种到平皿中,然后在无血清培养基中育三天产生完整的细胞层,EDTA处理掉上层细胞,保留下层的细胞外基质。2)随后将预悬浮处理的HaCaT细胞接种到预包被ECM的平皿中,细胞在EGF-free KBM培养基中孵育。接种后36小时收集细胞,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡比率。在低密度接种HaCaT细胞96小时后,采用MTT法检测细胞的增殖水平。3)HaCaT细胞接种到预包被ECM的平皿中,细胞在EGF-free KBM培养基中孵育。在接种后不同时间点收集细胞,Western blot法检测FAK、ERK1/2和AKT磷酸化水平的变化。4)在实验中预先采用细胞松弛素D,U0126 and wortmaninn分别处理细胞,接种后36小时收集细胞,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡比率。在低密度接种HaCaT细胞96小时后,采用MTT法检测细胞的增殖水平。在接种后不同时间点收集细胞,Western blot法检测FAK、ERK1/2和AKT磷酸化水平的变化。结果1)给予皮肤成纤维细胞连续的亚细胞毒剂量的UVB辐射,可诱导细胞稳定出现衰老相关的标记,如:衰老相关的半乳糖苷酶活性增高。并制备出由UVB应激诱导的成纤维细胞和未衰老成纤维细胞分泌的细胞外基质包被的平皿。2)结果显示UVB-SIPS成纤维细胞分泌的ECM较未衰老成纤维细胞分泌的ECM和空白ECM的促增殖效果分别高13.15%and 29.27%（p＜0.05）。空白ECM组、未衰老ECM组和UVB-SIPS ECM组测得发生平均4.01%,5.47%和7.12%的凋亡。与空白组比较,未衰老ECM组和UVB-SIPS组细胞S期的比例分别增高23.68%和8.55%（P＜0.05）。3)实验发现HaCaT细胞粘附于ECM（空白组、未衰老ECM组、UVB-SCIP ECM组）时,可时间依赖性的激活FAK和ERK1/2,两者磷酸化水平在30分钟开始升高,在120分钟达到高峰,来源于UVB-SIPS成纤维细胞的ECM可诱导最快而强烈的ERK1/2和FAK的活化;AKT无论在悬浮或贴壁的情况下均有轻度的磷酸化,而且三组中似乎未见显著的差异。在细胞粘附中,时相性AKT仅发生轻微增加。4)U0126预处理可完全阻断三组细胞的ERK磷酸化,阻断ERK信号途径完全抑制了ECM的促进增殖的效应;wortmannin预处理显著增加三组的凋亡率,分别为15.8%、23.4%和21.8%;2μM细胞松弛素D可抑制细胞-ECM相互作用诱导的AKT磷酸化,并明显减少了FAK磷酸化水平,同时细胞的凋亡率显著增加,从而抑制ECM对细胞增殖的促进作用。结论1)本研究显示反复亚细胞毒剂量的UVB应激可导致成纤维细胞衰老,这一模型的建立为研究UVB应激诱导的衰老是否具有促进上皮细胞增殖以及光老化的促肿瘤机制提供了可能。2)结果提示UVB-SCIP成纤维细胞分泌的ECM可以更强的促进HaCaT细胞的增殖,此效应更多依赖加快细胞倍增,而不是减少细胞的凋亡。3)来源于UVB-SIPS成纤维细胞的ECM可诱导最快而强烈的ERK1/2和FAK的活化,就AKT来看,三组中均可观察到轻度活化,但这种差异并无显著性。4)ERK1/2信号途径是通过加速细胞进程促进细胞的增殖,而不是减少失巢和EGF-free诱导的凋亡;细胞粘附中,时相性AKT仅发生轻微增加,这种轻度但可检测到的AKT活化仍然具有生物学活性,在本系统中PI3-K/AKT是一个重要的抗凋亡信号通路,该信号通路受抑制可完全破坏UVB-SCIP成纤维细胞分泌的ECM的促细胞增殖作用。

论文目录

• 文中缩略词
• 全文中文摘要
• 全文英文摘要
• 全文引言
• 一、研究背景
• 二、研究方法
• 三、研究目的
• 第一部分 紫外线应激诱导的衰老成纤维细胞模型的建立、鉴定以及ECM的制备
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 衰老成纤维细胞分泌的细胞外基质对HaCaT细胞凋亡、细胞周期和增殖的影响
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 UVB-SIPS成纤维细胞分泌的ECM对HaCaT细胞胞内信号的影响
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 第四部分 细胞松弛素D,U0126和渥曼青霉素对衰老成纤维细胞分泌的ECM的生物学效应的影响研究
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录一:发表英文论著
• 附录二:JID收录摘要
• 附录三:实验试剂和设备
• 致谢
• 综述 细胞衰老和紫外线应激性衰老