尼罗罗非鱼性别决定机制和性别相关的分子标记

论文摘要

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）已成为世界性的主要养殖对象之一，研究表明其遗传性别决定类型为XX／XY型。对不同遗传型尼罗罗非鱼的有丝分裂中期相染色体进行荧光原位杂交表明，在尼罗罗非鱼中，X与Y染色体之问存在差异。但是到现在为止，没有发现性别特异分子标记。遗传性别的快速鉴定问题是尼罗罗非鱼性别控制研究中的一个难点。本文从DNA水平对雌雄尼罗罗非鱼进行比较，研究其性别控制机理，筛选能区分雌雄的分子标记。主要研究结果如下：1．本文参照不同物种DM结构域设计了一对兼并引物，以尼罗罗非鱼精巢RNA为模板，通过RT-PCR方法，扩增出一条带，长约140bp。对扩增产物进行克隆，阳性克隆采用SSCP分析筛选不同基因片段，进一步对筛选的不同基因进行了DNA测序。结果获得2个不同的Dmrt基因，与GenBank联机，采用BLAST方法与人类相应DMRT基因进行序列比对，发现与人类相应DMRT基因的氨基酸序列一致性分别为：89.1％、100％，显示出Dmrt基因在系统进化上具有高度的保守性。根据尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的拉丁文名，按习惯将其命名为onDmrt1，onDmrt2。为了探讨Dmrt1和Dmrt2两个基因的功能，根据获得的序列，分别设计一对特异引物，采用RT-PCR技术，对尼罗罗非鱼不同组织Dmrt1和Dmrt2基因的表达进行了研究。结果发现Dmrt2基因在精巢，卵巢，脑，眼，鳃，心脏中都有表达，暗示Dmrt2基因的功能可能主要是参与器官发育，而不是性别决定过程。而Dmrt1只在精巢中特异表达，在其它组织中无表达，显示Dmrt1基因主要在性别决定及性状维持中有重要功能。根据扩增出的Dmrt1 DM-domain的序列，设计上游引物P5，P6，用3‘RACE（rapid amplification of cDNA ends）法从尼罗罗非鱼精巢中分离和测定了Dmrt1 cDNA的序列，3’-RACE扩增得到1108bp的片段，共编码262个氨基酸，奥利亚罗非鱼、虹鳟、新月鱼、青鲻等动物的Dmrt 1的氨基酸序列进行比较，同源性分别为：99％，62％，73％，41％。以Dmrt 1基因组序列为基础，采用Garnier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schulz方法预测蛋白质的二级结构；按Kyte-Doolittle方案、Emini方案和Jameson-Wolf方案预测DMRT1蛋白的B细胞表位，为精确地研究DMRT1蛋白的结构和功能，从而揭示他们的性别调控机能提供参考。2．参照人SRY基因HMG-box保守区序列，设计一对兼并引物，采用PCR技术扩增了尼罗罗非鱼Sox基因，在雌雄尼罗罗非鱼个体中均扩增出五条带，大小分别约为200 bp，400 bp，600 bp，800 bp，1200bp，回收200bp左右扩增产物进行克隆，阳性克隆采用SSCP分析，筛选不同基因片段。进一步对筛选的不同基因进行DNA测序，结果获得了五个不同的228bp Sox基因，与GenBank联机，采用BLAST方法与人类相应SOX基因进行序列比对，发现其与人类相应SOX蛋白的氨基酸序列一致性分别为97.2％、97.2％、94.4％、96％、88.2％，显示出该基因在分子进化上具有高度的保守性。根据尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的拉丁文名，按习惯将其命名为onSox1a、onSox1b、onSox3、onSox4 and onSox12。采用RT—PCR技术，研究了尼罗罗非鱼精巢、卵巢、脑、眼、鳃和心脏等组织中Sox3基因的表达。结果显示，Sox3基因在精巢、卵巢、脑和眼中有不同程度表达，而在鳃和心脏中无表达，，证实Sox3基因在其中枢神经系统的发育，性腺发生和功能维持上有着重要功能。本研究为探索尼罗罗非鱼的性别决定机制和Sox基因表达模式提供了资料。3．采用RAPD技术对尼罗罗非鱼雌、雄各11尾个体共22个样本进行性别和遗传多样性检测。从80个寡聚核苷酸随机引物中筛选出17个扩增重复性好、条带清晰、特异性强的引物，对每个个体基因组DNA进行了扩增。得到RAPD产物的分子量在200-2000bp之间，产物总计127个位点，其中，多态位点45个（占35.43％）。计算个体间遗传相似系数平均为0.8648，个体间遗传距离平均为0.1352。用Shannon多样性指数量化的遗传多态度（H0），雄性群体（0.1910）高于雌性群体（0.1797），平均遗传多态度（Hpop）为0.1854。尼罗罗非鱼遗传多态度所占的比例在群体内为13.63％，而雌、雄群体间为86.37％。在尼罗罗非鱼雌、雄个体RAPD产物中，电泳图谱上不能读出明显的雄性特征带。4．利用AFLP技术，应用49个引物组合，检测了尼罗罗非鱼雌雄基因组DNA的多态性，筛选与尼罗罗非鱼性别相关的分子标记。实验中共扩增出2694条带，筛选出候选差异DNA片段748条。挑选出20对引物进行雌雄两代个体进一步的分析。其中引物E4／M5组合产生1个大小约为150bp的片段，在所有两代雄性尼罗罗非鱼均出现这一片段，在F1代的15尾雌尼罗罗非鱼中有仅有1尾出现该片段，对F2代15尾雌尼罗罗非鱼也只有2出现，由此推断此条带可能与性别相连锁。对该特异扩增带经回收和测序，为了将AFLP标记转化为重复性和特异性更好的SCAR（Sequence Characterized Amplified Regions）标记，根据序列分析结果，分别合成了一对20碱基特异性引物，用该特异性引物进行PCR扩增，结果雄性有一条SCAR标记，而雌性没有。尼罗罗非鱼的SCAR分子标记能用于筛选全雄品系。

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摘要

Abstract

第一章文献综述

第1节鱼类性别和性染色

1 鱼类性别

2 鱼类的性染色体类型

2.1 XY型

2.2 ZW型

2.3 XO型

2.4 ZO型

2.5 复性染色体型

2.6 常染色体型

3 性染色体的识别

3.1 通过遗传标记研究,判断性决定体系

3.2 通过诱导性逆转,来判断其性决定体系

3.3 通过染色体的形态差异,来判断性决定体系

3.4 通过染色体带型差异,来判断性决定体系

3.5 种间杂交,来判断性决定体系

3.6 人工诱导鱼类单性发育,来判断性决定体系

3.7 通过分子标记,来判断性决定体系

4 鱼类性染色体的基本特征

5 遗传性别决定和环境性别决定

5.1 遗传性别决定（GSD）

5.2 环境性别决定型（ESD）

5.2.1 温度对鱼类性别的影响

5.2.2 激素对鱼类性别的影响

5.3 遗传性别决定与温度依赖性性别决定关系

第2节鱼类性别决定的分子遗传学研究概况

1 性别分子遗传基础研究

2 鱼类性染色体

3 性别决定机制假说

4 鱼类中可能的性别相关基因

4.1 BKM（Banded kraint minor）卫星DNA

4.2 重复序列

4.3 ZFY

4.4 H-Y抗原

4.5 SRY

4.6 SOX基因家族

4.7 DMY

4.8 DMRT1

5 性染色体特异片段与性别遗传鉴定

6 鱼类性别决定的分子基础研究的意义

6.1 对脊椎动物进化生物学的意义

6.2 对于鱼类性别控制育种的意义

6.3 对环境生物学的意义

7 本研究的目的和意义

第二章尼罗罗非鱼Dmrt基因克隆和不同组织中的表达

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 引物

2.3 药品和试剂

2.3.1 菌株和质粒

2.3.2 主要化学试剂

2.3.3 培养基的配制

2.3.4 有关质粒DNA提取的溶液配制

2.3.5 常用缓冲液及试剂的配制

2.4 基因组DNA提取

2.5 RNA提取

2.6 cDNA合成

2.6.1 第一链cDNA的合成

2.6.2 SMARTcDNA的引物延伸合成

2.7 DM-domain区的扩增

2.8 PCR产物的克隆

2.8.1 PCR产物的回收

2.8.2 连接反应

2.8.3 转化（氯化钙法）

2.9 重组克隆的鉴定

2.9.1 阳性克隆的筛选鉴定

2.9.2 碱解法小量提取质粒DNA

2.9.3 PCR鉴定

2.10 SSCP分型

2.11 阳性克隆的序列分析

2.12 3’-RACE

2.13 RACE产物的克隆

2.14 不同组织RT-PCR反应

3 结果

3.1 总RNA完整性的检测

3.2 cDNA的合成

3.3 DM-domain区的扩增

3.4 DM-domain克隆产物的鉴定

3.5 SSCP分析

3.6 序列分析

3.7 Dmrt 1基因的3’RACE反应及RACE产物克隆

3.8 Dmrt 1的序列分析

3.9 Dmrt 1蛋白质二级结构预测

3.10 Dmrt 1蛋白的B细胞表面可能性预测结果

3.11 Dmrt 1基因的表达

3.12 Dmrt 2基因的表达

4 讨论

4.1 Dmrt基因家族及其保守性

4.2 Dmrt1蛋白质二级结构

4.3 Dmrt1和Dmrt2基因的表达与性别的分化发育

第三章尼罗罗非鱼Sox基因保守区的克隆和Sox3表达分析

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 试剂

2.3 引物

2.4 基因组DNA提取

2.5 RNA提取

2.6 HMG-boxPCR扩增

2.7 PCR产物的克隆

2.8 SSCP分析

2.9 Sox基因测序和分析

2.10 RT-PCR

3 结果与分析

3.1 Sox基因HMG-box的扩增

3.2 克隆的结果

3.3 SSCP分析

3.4 Sox基因序列分析

3.5 不同物种Sox基因的同源性分析

3.6 RNA提取结果

3.7 Sox3不同组织RT-PCR扩增结果

3.8 Sox3 HMG-box二级结构预测

3.9 Sox3 HMG-box的B细胞表面可能性预测结果

4 讨论

4.1 SRY基因

4.2 Sox基因的内含子

4.3 Sox基因中HMG基序的DNA结合特性

4.4 Sox3基因

第四章用用RAPD鉴定尼罗罗非鱼雌雄差异和遗传多态性

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 主要试剂

2.3 研究方法

2.3.1 基因组DNA的制备

2.3.2 PCR反应

2.3.3 琼脂糖电泳

2.4 数据处理

2.4.1 结果记录

2.4.2 多态位点百分率

2.4.3 个体间遗传相似系数

2.4.4 群体遗传多态度

3 结果

3.1 尼罗罗非鱼RAPD扩增及其标记

3.2 尼罗罗非鱼个体水平DNA多态性

3.3 雌、雄群体遗传多样性

4 讨论

4.1 雄性标记的筛选

4.2 尼罗罗非鱼群体遗传多样性

4.3 RAPD技术的可靠性

第五章尼罗罗非鱼AFLP技术体系的优化

1 前言

2 材料和方法

2.1

2.1.1 材料

2.1.2 主要试剂

2.2 基因组DNA的制备

2.3 AFLP体系

2.3.1 酶切与连接

2.3.1.1 单酶切与连接

2.3.1.2 双酶切与连接

2.3.2 酶切片段的扩增

2.3.2.1 单酶水解片段的扩增

2.3.2.2 双酶水解片段的扩增

2.3.3 扩增产物的凝胶分析

2.3.3.1 琼脂糖凝胶分析

2.3.3.2 小面积凝胶分析

2.3.3.3 测序凝胶电泳分析

2.3.4 染色

3 结果

3.1 酶切

3.2 琼脂糖凝胶分析

3.3 小面积凝胶分析

3.4 测序凝胶电泳分析

3.5 银染

4 讨论

第六章用AFLP和SCAR分子标记对尼罗罗非鱼性别鉴定

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 DNA的提取

2.3 AFLP实验程序

2.3.1 酶切

2.3.2 连接反应

2.3.3 预扩增

2.3.4 选择性扩增

2.3.5 变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

2.4 从PAGE胶中回收DNA片段

2.5 第2轮PCR扩增

2.6 差异带的回收,及测序

2.7 SCAR引物的设计

2.8 SCAR-PCR反应

2.9 DNA克隆与测序

3 结果

3.1 适用AFLP分析的DNA模板的制备

3.2 酶切

3.3 模板DNA片段与接头的连接

3.4 预扩增反应

3.5 选择性扩增

3.6 特异带的回收

3.7 T1序列分析

3.8 SCAR引物的设计

3.9 PCR特异扩增

3.10 T1标记的验证

4 讨论

4.1 影响AFLP分析的因素

4.2 尼罗罗非鱼雌雄差异

4.3 SCAR标记的转换

4.4 尼罗罗非鱼性别的影响因数

4.5 鱼类性别分子鉴定

5 小结

参考文献

英文缩略词表

致谢

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