人乳头瘤病毒16亚型L1基因在毕赤酵母GS115中的优化表达

论文摘要

优化HPV16L1基因在Pichia Pastoris酵母中的表达。首先用酵母偏爱密码子对HPV16型L1基因进行优化并用引物延伸法合成该基因,将该基因构建到分泌型酵母表达载体pPICZαB形成整合质粒,电击转化GS115酵母细胞,筛选阳性重组子,经SDS-PAGE电泳、Western-Blot检测,选取表达量较高的菌株进行摇瓶表达,并摸索优化表达条件,5L发酵罐表达蛋白,初步建立稳定的发酵工艺。发酵上清经SDS-PAGE电泳检测显示,其中有特异蛋白条带,且在第四天表达量最高,表达产物单体分子量为55,000Da左右。发酵上清液经纯化,可获得纯度为90%以上的HPV16L1蛋白,电镜观察,所得HPV16L1蛋白可自组装成病毒样颗粒（VLPs）,直径约为55nm。结果表明,HPV16L1基因经过密码子优化和发酵条件的摸索,在Pichia Pastoris酵母中能够稳定地表达。

论文目录

• 内容提要
• 第一章 前言
• 1.1 HPV 研究背景
• 1.1.1 HPV 的分子生物学
• 1.1.2 HPV 的流行病学
• 1.1.3 HPV 疫苗的研究现状
• 1.1.4 表达载体的选择
• 1.2 本论文设计思路
• 1.2.1 实验目的
• 1.2.2 设计思路
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 材料、仪器和试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 常用试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 HPV16L1 基因的优化设计与合成
• 2.2.2 将HPV16L1 基因构建至表达载体
• 2.2.3 毕赤酵母重组子的制备与筛选
• 2.2.4 酵母重组子的5L 发酵罐表达
• 2.2.5 蛋白的纯化与鉴定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 HPV16L1 基因的设计合成
• 3.1.1 合成L1 基因第一段
• 3.1.2 合成L1 基因第二段
• 3.1.3 合成L1 基因第三段
• 3.1.4 三段连接得到完整的HPV16L1 基因
• 3.2 HPV16L1 基因构建至表达载体
• 3.2.1 L1 基因连T-easy 载体
• 3.2.2 L1 连pPICZαB 真核表达载体
• 3.3 酵母重组子的获得与筛选
• 3.3.1 转化子的获得
• 3.3.2 PCR 筛选酵母重组子
• 3.3.3 摇瓶筛选酵母重组子
• 3.4 摇瓶发酵优化HPV16L1 基因表达条件
• 3.4.1 优化基础盐培养基
• 3.4.2 添加维生素
• 3.4.3 添加蛋白胨
• 3.5 重组子发酵罐表达
• 3.6 VLP 蛋白纯化及电镜观察
• 3.6.1 VLP 蛋白纯化
• 3.6.2 VLP 电镜结果
• 参考文献
• 摘要
• Abstract
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介