猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的表达研究及其单克隆抗体的制备

论文摘要

猪瘟（classical swine fever;CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus;CSFV）引起的猪的一种高度接触性、急性传染病,以发热和出血为主要特征。CSFV囊膜糖蛋白E2含有A、B、C、D四个抗原结构域,是其最主要的保护性抗原,它能够诱导机体产生中和抗体,并保护猪抵抗强毒的攻击。E2最易变异,是CSFV三种糖蛋白中保守性最低的蛋白,常用于基因工程疫苗和鉴别诊断的靶目标,一直都是CSFV研究的热点。本研究中分别采用原核表达系统和杆状病毒表达系统对E2蛋白进行了表达,并制备了3株抗CSFV E2蛋白的单克隆抗体,为猪瘟病原快速诊断方法的建立奠定了基础。1.CSFV E2蛋白在原核和杆状病毒系统中的表达研究我们首先分析CSFV E2蛋白的特性,选择用原核表达系统表达E2基因的不同抗原表位区。根据E2基因序列,设计并合成2对引物,分别用于扩增E2基因ABCD抗原区和AD抗原区。将扩增得到的不同E2基因的片段克隆至pMD18-T载体中,获得pT-E2/ABCD和pT-E2/AD重组质粒。经核苷酸序列测定,E2基因ABCD抗原区和AD抗原区分别长645bp和300bp,编码215个氨基酸和100个氨基酸。将得到的不同抗原区基因片段克隆至pGEX-KG表达载体中获得了重组表达载体pKGE2ABCD和pKGE2AD,与载体GST蛋白形成融合表达蛋白。经鉴定后,转化大肠杆菌BL21-condonplus-RIL感受态细胞,IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达蛋白为融合蛋白,分子量分别约为50kDa和36kDa,表达产物主要以包涵体的形式存在;Western blot检测表明,表达产物能与CSFV阳性血清发生特异性反应,具有良好的生物学活性。杆状病毒表达系统常用于外源病毒蛋白的表达,表达的蛋白能够保持良好的抗原性。在本研究中,我们选择杆状病毒Bac to Bac表达系统。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pT-E2,回收E2片段,克隆至pFastBac-HT载体中构建了pFastBac-E2;转化DH10Bac感受态细胞并在菌体中发生转座,构建了重组杆状病毒穿梭表达载体Bacmid-E2,经PCR鉴定证实E2基因成功整合到了杆状病毒基因组。最后转染Bacmid-E2到SF-9细胞,获得重组杆状病毒,连续扩大病毒3代后用于蛋白表达。间接免疫荧光结果显示感染重组杆状病毒的sf9昆虫细胞可以发荧光,但反应不强,目的蛋白表达量太低,不能用于后续研究。2.猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备将上述原核表达的蛋白纯化后,免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用间接ELISA法进行筛选,采用有限稀释法对其进行克隆,经过3次融合共获得3株能稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为4H5、1C7和4H4。其中4H5和1C7株为针对E2 ABCD表位单克隆抗体,4H4为针对E2 AD表位单克隆抗体。细胞上清和腹水的效价分别为0.4×103、0.8×103、0.4×103和0.2×106、0.5×105、0.4×106,抗体类型为IgG2a、IgG2b和IgG1。间接免疫荧光试验显示3株单克隆抗体都可以和CSFV发生特异性结合,其中4H5和4H4和病毒的反应强于1C7。Western blot检测结果表明,4H5和4H4均可以和CSFV发生反应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（ABBREVIATION）
• 第一部分 文献综述
• 1.1 分类及基本特性
• 1.1.1 分类及理化特性
• 1.1.2 体外生长增殖特性
• 1.2 CSFV分子流行病学研究
• 1.3 CSFV分子生物学研究
• 1.3.1 CSFV的基因组结构
• 1.3.2 CSFV基因组编码的蛋白及功能
• 1.4 CSFV的检测
• 1.4.1 病毒分离鉴定
• 1.4.2 动物接种试验
• 1.4.3 兔体交叉免疫试验
• 1.4.4 荧光抗体试验
• 1.4.5 新城疫病毒（NDV）强化试验
• 1.4.6 酶联免疫吸附试验
• 1.4.7 免疫酶染色试验
• 1.4.8 荧光抗体病毒中和试验
• 1.4.9 反转录聚合酶链式反应
• 1.4.10 多重聚合酶链式反应
• 1.4.11 核酸探针杂交试验
• 1.4.12 基因芯片检测技术
• 1.4.13 荧光定量聚合酶链式反应
• 1.5 单克隆抗体在CSFV诊断及分子生物学研究中的应用
• 1.6 昆虫杆状病毒表达系统（BEVS）研究进展
• 1.6.1 杆状病毒表达系统简介
• 1.6.2 CSFV E2基因在昆虫细胞中表达研究进展
• 第二部分 猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的表达
• 2.1 目的与意义
• 2.2 材料
• 2.2.1 毒株、菌种和载体
• 2.2.2 工具酶和主要试剂
• 2.2.3 血清和酶标抗体
• 2.2.4 主要试剂及溶液配置
• 2.3 方法
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 总RNA的制备
• 2.3.3 RT-PCR扩增与检测
• 2.3.4 PCR产物回收
• 2.3.5 克隆质粒的构建
• 2.3.6 重组原核表达质粒的构建
• 2.3.7 重组杆状病毒的构建
• 2.3.8 目的基因的原核表达
• 2.3.9 目的基因的杆状病毒表达
• 2.3.10 SDS-PAGE电泳
• 2.3.11 Western blot检测
• 2.3.12 杆状病毒表达间接免疫荧光
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 E2基因RT-PCR扩增结果
• 2.4.2 E2基因ABCD和AD抗原区PCR扩增结果
• 2.4.3 重组原核表达质粒的酶切鉴定
• 2.4.4 pFastBac-E2的酶切鉴定
• 2.4.5 Bacmid-E2的PCR鉴定
• 2.4.6 E2基因在大肠杆菌的表达
• 2.4.7 最佳诱导时间
• 2.4.8 表达产物的可溶性分析
• 2.4.9 表达产物的纯化
• 2.4.10 诱导表达及Western blot分析
• 2.4.11 杆状病毒在昆虫细胞上的增殖
• 2.4.12 E2蛋白重组杆状病毒表达间接免疫荧光结果
• 2.5 讨论
• 2.5.1 CSFV的增殖
• 2.5.2 引物设计
• 2.5.3 原核表达
• 2.5.4 昆虫细胞/杆状病毒表达系统
• 第三部分 猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
• 3.1 目的与意义
• 3.2 材料
• 3.2.1 生物材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 细胞培养用试剂及相关试剂
• 3.2.4 融合细胞染色体计数用试剂
• 3.2.5 腹水纯化用试剂
• 3.2.6 ELISA相关试剂
• 3.2.7 其它试剂
• 3.3 方法
• 3.3.1 抗原制备
• 3.3.2 小鼠免疫
• 3.3.3 间接ELISA检测方法的建立
• 3.3.4 细胞融合
• 3.3.5 阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化
• 3.3.6 杂交瘤细胞冻存和复苏
• 3.3.7 单克隆抗体的鉴定
• 3.3.8 单克隆抗体稳定性鉴定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 间接ELISA方法的建立
• 3.4.2 融合后筛选及克隆化培养结果
• 3.4.3 杂交瘤细胞及单克隆抗体的特性鉴定
• 3.4.4 间接免疫荧光结果
• 3.4.5 Western blot检测
• 3.4.6 腹水纯化结果
• 3.4.7 单克隆抗体的稳定性分析
• 3.5 讨论
• 3.5.1 单克隆抗体制备
• 3.5.2 单克隆抗体与CSFV毒株的反应
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录