论文摘要
背景和目的肺癌是目前发病率较高的恶性肿瘤之一，其病死率居恶性肿瘤的首位，尽管近十年来科学技术得到迅猛的发展，但肺癌患者的总体生存率并无明显的的改善，其5年生存率不足15％。肺癌目前的治疗仍多采用手术、化疗、放疗等，生物靶向治疗是近年肺癌治疗上的突破及研究热点，靶点药物目前主要还是针对非小细胞肺癌的。随着分子生物学研究的不断进展，科学工作者们越来越清楚地认识到肺癌的发生和发展是一个多基因参与的多步骤的过程，RNAi作为基因治疗中一种新的效率高、特异性强的治疗手段愈来愈多地受到人们的重视。RNAi是指由长约21-23个核苷酸的双链RNA分子（siRNA，small interference RNA）介导的以序列特异的方式抑制同源基因表达的一种转录后抑制现象。其作用机制可概括为：外源或内源性dsRNA被Dicer酶切割成21-23nt的双链siRNA（small interference RNA），双涟siRNA与一种蛋白复合物结合形成RNA诱导沉默复合物RISC（RNA-induced silencing complex），在解旋酶作用下，由ATP供能，RISC被激活，siRNA解开双链，正义链被释放，反义链介导活化的RISC根据碱基互补配对原则特异性识别并结合靶mRNA，切割mRNA，并由核酸外切酶将切割片段彻底降解，从而抑制基因表达。Akt是一种编码丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的基因，因其蛋白质产物有与PKA和PKC高度近似的催化结构域，被命名为蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）。Akt在上游众多调节因子的作用下对下游众多底物产生作用，其下游的众多底物目前多被证实为癌基因、抑癌基因、生长因子、促凋亡因子、促血管生成因子等，故Akt在肿瘤的发生、转移、抗药性、抵抗放射性均发生着重要作用。AKt2在胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌及肺癌中均有较高的检出率；我们以Akt2为靶点，利用RNAi技术使该基因显示出沉默效应，为进一步探讨该基因功能及肺癌治疗新方法提供实验基础。方法利用GenBank中已知AKT2的mRNA基因序列（M95936），经Blast筛选，设计并合成具有发卡结构的siRNA，将构建的基因片段与克隆载体pGEM-T Easy连接，利用蓝白筛选和T7／SP6 PCR扩增筛选鉴定重组子pGEM-T-Akt2，对插入序列进行DNA序列分析；用BamHI和XhoI双酶切重组子pGEM-T-Akt2和siRNA表达载体pRNAT-U6.2；将双粘Akt2发卡样siRNA片段亚克隆入线化的siRNA表达载体pRNAT-U6.2中；利用PCR法筛选鉴定重组子pRNAT-U6.2-Akt2；将siRNA表达载体pRNAT-U6.2-Akt2转染入人肺癌细胞系NCI-H446细胞中，用G418培养液进行筛选，荧光显微镜观察转染效果，RT-PCR检测AKT2-mRNA沉默效果。结果1．利用GenBank中已知AKT2的mRNA基因序列（M95936），经Blast筛选，最后确定19个序列的编码碱基GGTGTCTGTCATCAAAGAA（即96-114nt）。2．siRNA发卡DNA退火后，电泳可见明亮条带位于约70bp处，与设计完全一致。3．退火产物与pGEM-T Easy连接后，转化JM109，筛选鉴定后得到重组子pGEM-T-Akt2，鉴定结果与预期完全一致。4．pGEM-T-Akt2重组体筛选鉴定后DNA测序结果与设计完全一致。5．亚克隆后，用BamHI和XhoI对重组质粒及表达载体质粒进行双酶切鉴定，并连接得到pRNAT-U6.2-Akt2，利用设计引物进行PCR筛选鉴定，得到阳性克隆。6．转染pRNAT-U6.2-Akt2的实验组人肺癌细胞系NCI-H446细胞中Akt2-mRNA表达被明显抑制，而空质粒转染对照组和空白对照组中都存在较高水平的Akt2-mRNA表达。结论1．成功设计并合成出针对Akt2的具有发卡结构siRNA片段。2．成功构建出针对Akt2的siRNA表达载体pRNAT-U6.2-Akt2。3．应用pRNAT-U6.2-Akt2转染人肺癌细胞系NCI-H446细胞能显著沉默Akt2mRNA的表达。