论文摘要
背景和目的:原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病隐匿,早期发生浸润和转移,手术切除率低,放疗和化疗敏感性低,肝移植、免疫和介入治疗效果均不理想。分子靶向治疗是目前原发性肝癌治疗研究的热点和希望之一。随着分子生物学的迅速发展以及人们对原发性肝癌分子机制认识的进一步加深,肝癌细胞信号转导的分子机理研究成为关键,通过深入研究原发性肝癌发生、粘附、侵袭、扩散与转移信号转导中关键的调控基因,对于阐明原发性肝癌发病分子机理具有重要意义。BTG2PC3/TIS21属于瞬时早期反应基因,是具有抗增殖作用特性的一组基因家族成员。其参与了细胞分化、发育、凋亡、肿瘤细胞抑制等各种生理及病理过程并发挥着重要的作用[1-5]。同时,该基因与抑癌基因RB,P53,P73等具有密切的联系,被认为可能是一种新的抑癌基因[6-7]。但到目前为止,由于缺乏其在肿瘤中突变的直接证据,其作为抑癌基因结论还不能确定。因此,探寻BTG2PC3/TIS21在肿瘤中的表达及其相互作用分子对证明其是抑癌基因具有十分重要的意义。我们前期工作通过利用RDA方法建立了成年大鼠2/3肝部分切除后1h和四月人胎肝选择表达基因的EST库,首次发现并论证了BTG2PC3/TIS21是一种与肝再生调控密切相关的早期反应基因[8-10]。目前国内外关于BTG2PC3/TIS21文献报告很少,而其在肝细胞癌中的表达和功能研究更是空白。由于BTG2PC3/TIS21在肝细胞癌中作用的“未知性”,我们通过建立改进性二乙基亚硝胺（DEN）诱发的大鼠肝癌模型,动态观察BTG2PC3/TIS21基因在肝癌发生过程中表达情况,探讨其与P53、cyclinD1表达的相关性,同时分析BTG2PC3/TIS21与P53、cyclinD1、cyclinE在肝细胞癌组织芯片中的表达及其临床联系,为阐明BTG2PC3/TIS21是抑癌基因提供依据。方法:1、建立改进性二乙基亚硝胺诱发的大鼠肝癌模型;利用HE染色,透射电镜动态观察诱癌过程中大鼠肝脏癌变的组织变化过程。2、用RT-PCR和Western Blot方法,分别检测诱癌过程中BTG2PC3/TIS21和P53、cyclinD1mRNA及蛋白表达,探查它们之间的相关性。3、分别用RT-PCR和Nothern blot方法检测胎肝组织、肝癌细胞7701、7721、HepG2中BTG2PC3/TIS21mRNA表达情况。4、原位杂交技术检测临床肝细胞癌组织芯片中BTG2PC3/TIS21mRNA的表达,并分析BTG2PC3/TIS21mRNA的阴性表达病人P53、cyclinD1、cyclinE蛋白的表达情况。5、免疫组织化学方法检测组织芯片中BTG2PC3/TIS21蛋白和P53、cyclinD1、cyclinE蛋白的表达。结果:1、诱癌过程中大鼠肝组织变化16周以后诱癌组大鼠成癌率为96%（24/25）,大鼠肝癌癌变过程大致经过肝细胞损伤期、肝细胞增生硬化期和肝细胞癌变期等三个时期,不同时期肝细胞的核、核仁、胞质内糖原以及胞质内细胞器的病理形态学改变有一定规律,观察到肝细胞吞噬细胞现象。2、DEN诱发大鼠肝癌过程中BTG2PC3/TIS21、P53、cyclinD1的mRNA的表达情况利用RT-PCR的方法检测诱癌不同阶段大鼠肝组织BTG2PC3/TIS21、P53、cyclinD1的mRNA的表达变化,发现正常对照大鼠肝组织中BTG2PC3/TIS21mRNA未见表达,加入DEN诱癌后BTG2PC3/TIS21mRNA表达迅速增加,表达高峰为诱癌5周,到诱癌成功后其表达降低。P53mRNA在对照组中低表达,DEN诱癌前期表达增高,高峰为诱癌5周,此后持续降低,诱癌16周后表达与对照组相当。cyclinD1mRNA在正常和诱癌早期大鼠中都未见表达,12周后开始增加,16周达最高。3、DEN诱发大鼠肝癌过程中BTG2PC3/TIS21、P53、cyclinD1蛋白的表达情况BTG2PC3/TIS21蛋白在诱癌早期5周时表达最高,经过诱癌间歇期后表达持续降低,到肝癌形成后（诱癌16周）达最低,低于正常对照大鼠的表达;P53在诱癌早期及中期（5-12周）持续增高,到成癌后降低,其中正常对照大鼠中未见其表达;cyclinD1在整个诱癌过程中表达都高于正常对照大鼠,在肝癌形成时（16周）达增高的高峰。4、BTG2PC3/TIS21mRNA在胎肝,LO2和7701,7721细胞株中表达,在HepG2细胞中表达缺失;BTG2PC3/TIS21mRNA在肝细胞组织芯片中表达缺失率为28.81%;在BTG2PC3/TIS21mRNA阴性表达的组织中,P53表达的阳性率为82.35%,cyclinD1蛋白为94.12%阳性表达,cyclinE蛋白表达阳性率为76.47%;BTG2PC3/TIS21蛋白在HCC中表达主要位于胞浆,其缺失率为49.2%,其表达与HCC的病理分级有统计学差异,P53蛋白表达于胞核,其缺失率为55.9%,cyclinE表达于胞核,其缺失率为61.02%;HCC肿瘤组织中BTG2PC3/TIS21与P53、cyclinD1、cyclinE的表达呈负相关。结论:1、诱癌实验表明BTG2PC3/TIS21表达在诱癌剂所致的肝损伤早期时增高,晚期成癌时降低,存在明显的时空性表达。2、在肝癌形成过程中BTG2PC3/TIS21与P53表达可能存在正调控作用,而与cyclinD1可能存在负调控作用。3、BTG2PC3/TIS21在肝癌细胞中存在的异常表达和定位现象,BTG2PC3/TIS21核表达降低或缺失可能与HCC的进展有密切联系。4、BTG2PC3/TIS21的抗增殖作用方式调节不仅存在P53依赖的经典途径,而且还存在P53非依赖的旁路途径。5、BTG2PC3/TIS21可通过抑制cyclinD1和cyclinE在HCC中的表达来调控肝癌细胞的增殖。
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