酪蛋白非磷肽的制备及其ACE抑制活性的研究

论文摘要

酪蛋白中富含多种生物活性肽,酪蛋白磷酸肽（CPPs）是酪蛋白生物活性肽中被研究和开发最早的一种,具有结合矿物质的作用。一般在工业化生产CPPs过程中,有近80%的蛋白质副产物——酪蛋白非磷肽（CNPPs）未被合理利用,作为饲料或废物弃去。本论文中,在制备CPPs的同时回收其副产物CNPPs,并研究了大孔吸附树脂对它的脱盐效果及其中的血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽,为CNPPs的开发利用提供了理论基础。论文首先研究了Alcalase水解酪蛋白生产CPPs和CNPPs的工艺条件,实验结果表明,Alcalase对酪蛋白作用的最佳条件是:底物浓度5%（w/v）,加酶量0.03 mL·g-1蛋白质,温度60℃,pH值9.0。乙醇的浓度和酪蛋白的水解度（DH）对CPPs和CNPPs的得率以及CPPs的N/P（摩尔比）均有影响。当乙醇浓度70%（v/v）,DH值达到18%时,CPPs释放并沉淀完全,得率达到最高,为23.94%,N/P（摩尔比）是9.61,CNPPs得率为76.06%。CPPs和CNPPs的相对分子质量分布在2005000之间,其中低于700的肽含量最高,分别为61.52%和67.26%。CNPPs中的疏水性氨基酸含量远高于CPPs。由于在酪蛋白水解以及CPPs的沉淀过程中引入了大量无机盐,导致CNPPs产品的灰份含量高达20.88%,影响了对它活性的研究,更影响了它的品质,必须去除CNPPs中的无机盐,所以论文研究了大孔吸附树脂对CNPPs的脱盐效果。使用DA201-C型大孔树脂对CNPPs脱盐简便可行,60 mg·mL-1的CNPPs溶液上柱,用紫外检测器检测流出液的A220nm,以A220nm=0.05为透过点,水洗后用70%（v/v）乙醇解吸,流速为140 mL·h-1。CNPPs经大孔树脂处理后,脱盐率为95.40%, ACE抑制活性的IC50从0.35 mg·mL-1降低到0.21 mg·mL-1,而且多肽的回收率可以达到85%以上,同时该过程还伴随着明显的纯化作用。经体外消化实验发现,CNPPs经消化道酶作用后ACE抑制活性有所提高,说明在消化酶作用下,CNPPs中部分肽键被打断,成为更短的肽,短肽有益于抑制ACE活性。肽谱分析显示出CNPPs中肽的种类和组成非常复杂,这使得ACE抑制肽的分离纯化和结构鉴定成为一项比较困难但很有意义的工作。为了充分了解CNPPs作为降血压功能因子的潜力,本论文利用凝胶过滤色谱和RP-HPLC从CNPPs中分离得到一种ACE抑制肽CNPPs-8-2。采用LC/ESI-MS结合氨基酸分析证明CNPPs-8-2相对分子质量为291.1,推测其一级结构氨基酸序列为Ser-Trp。测定该组分的ACE抑制活性,其IC50为92.8μmol·L-1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 酪蛋白与其酶解产物生物活性多肽
• 1.1.1 酪蛋白的来源、成分和结构
• 1.1.2 酪蛋白水解物与功能性食品
• 1.1.3 牛乳酪蛋白活性肽产品的开发和应用现状
• 1.2 高血压
• 1.2.1 高血压的分类
• 1.2.2 高血压的危害
• 1.3 ACE 与高血压
• 1.3.1 ACE
• 1.3.2 ACE 对血压的调节作用
• 1.4 ACE 抑制肽
• 1.4.1 降血压机理
• 1.4.2 结构与功能关系
• 1.4.3 源于酪蛋白的ACE 抑制肽
• 1.4.4 源于其它食品蛋白质的ACE 抑制肽
• 1.5 立题背景及意义
• 1.6 本论文主要研究内容
• 第二章 ALCALASE 水解酪蛋白制备CNPPS
• 2.1 前言
• 2.2 材料和仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 成分分析
• 2.3.2 水解度（degree of hydrolysis, DH）的测定
• 2.3.3 CPPs 和CNPPs 得率的计算
• 2.3.4 Alcalase 水解酪蛋白工艺
• 2.3.5 CPPs 和CNPPs 的分离
• 2.3.6 CPPs 和CNPPs 相对分子质量分布测定
• 2.3.7 氨基酸组成分析
• 2.3.8 游离氨基酸的测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 Alcalase 水解酪蛋白水解曲线
• 2.4.2 Alcalase 水解酪蛋白工艺条件的探讨
• 2.4.3 CPPs 和CNPPs 的分离
• 2.4.4 CPPs 和CNPPs 的分子大小和组成
• 2.5 本章小结
• 第三章 CNPPS 的脱盐及其性质的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和仪器
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 大孔吸附树脂对CNPPs 进行脱盐
• 3.3.2 脱盐后CNPPs 的性质测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 紫外检测最佳波长的确定
• 3.4.2 大孔吸附树脂对CNPPs 的静态吸附能力
• 3.4.3 大孔吸附树脂对CNPPs 的动态吸附及解吸
• 3.4.4 最佳样品浓度的确定
• 3.4.5 最佳流速的确定
• 3.4.6 脱盐效果
• 3.4.7 脱盐后CNPPs 产品的理化性质及体外消化稳定性
• 3.5 本章小结
• 第四章 CNPPS 中ACE 抑制肽的分离纯化及结构分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料和仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 ACE 抑制活性的测定
• 4.3.2 Sephadex G-15 分离纯化CNPPs
• 4.3.3 氨基酸组成分析
• 4.3.4 RP-HPLC 分离纯化CNPPs
• 4.3.5 ACE 抑制肽的液质联用分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 凝胶过滤色谱对CNPPs 的分离
• 4.4.2 CNPPs 经Sephadex G-15 分离后各组分对ACE 的抑制作用
• 4.4.3 CNPPs-8 的氨基酸组成
• 4.4.4 CNPPs-8 的紫外扫描图谱
• 4.4.5 反相高效液相色谱分离纯化ACE 抑制肽
• 4.4.6 CNPPs-8-2 的结构分析
• 4.5 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士期间发表的论文