白菜同核异质雄性不育系与其保持系生物学差异比较及相关差异表达基因克隆

论文摘要

白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino）为异花授粉作物,存在明显的杂种优势。细胞质雄性不育系（Cytoplasmic male sterility,CMS）是白菜等芸薹属植物生产一代杂种的理想系统,CMS材料既是农作物利用杂交优势和群体改良的重要工具,又是研究花粉发育、质核质互作的理想材料。因此,白菜CMS的选育及其应用研究具有重要的理论意义和生产应用价值。本研究利用甘蓝型油菜（B.napus）的PolimaCMS和OguraCMS和与白菜‘矮脚黄’可育株进行杂交及连续回交,选育获得共享一个保持系（B）的白菜同核异质CMS材料:白菜‘矮脚黄’PolimaCMS（P）、白菜‘矮脚黄’OguraCMS（G）。我们拟对同一核背景下不同胞质雄性不育系与保持系做生物学差异比较分析,并对相关差异表达基因进行克隆与特征分析,有助于探明不同CMS的调控机制。主要研究结果如下:（1）不育形态比较研究表明,与B相比,白菜同核异质CMS都极显著地表现出花丝变短、花药白色、干瘪、不开裂等特征。但P和G雌蕊和蜜腺发育正常。在花蕾长3.5mm时B花药呈黄色,P和G花药没有变黄。初步证实选育获得的白菜同核异质CMS能用于杂种一代生产。（2）小孢子发生细胞学观察,表明P小孢子败育主要在四分体时期,绒毡层细胞提早发生程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）,表现为细胞质浓厚,因核仁物质弥散而使整个细胞染色较深。随后小孢子互相粘连成巨型团块和高度液泡化,导致花粉粒细胞质和核降解,剩下皱缩的药室囊;G小孢子败育主要在小孢子单核液泡期。小孢子母细胞形成后,绒毡层细胞高度液泡化,径向过度膨大,接着小孢子发生明显的质壁分离现象,最终每个皱缩的药室只剩下花粉外壁存在。（3）利用酶联免疫检测技术,研究花蕾早、中、晚期内源激素含量的动态变化及激素之间平衡关系。结果表明,不育花蕾JA、IAA和ZR含量低于B,但GA3含量高于B,这种差异在中期（约小孢子单核期）达到最大值。此外,IAA、GA3、ZR和JA之间的平衡也受到破坏。据此推测GA3含量骤增促进P绒毡层细胞的膨大;ZR含量过低致使P和G绒毡层细胞和小孢子细胞分裂受阻:JA亏缺是P和G花药不开裂和花丝变短的原因之一。（4）cDNA-AFLP分析早、中、晚花蕾核基因的差异表达。结果表明,B花蕾发育过程中核基因表达模式大致可分3类共7种类型:Ⅰ表达增强型（3种）、Ⅱ表达减弱型（3种）、Ⅲ表达一致型。白菜同核异质CMS花蕾核基因的表达模式大致可分3类共5种类型:Ⅰ花蕾核基因的表达趋势与同核异质无关、Ⅱ花蕾核基因的表达受同核异质的影响且趋势不一致（3种）、Ⅲ花蕾核基因的表达受同核异质的影响但趋势一致。将差异片段回收、克隆、测序,获得9个cDNA差异片段,在GenBank数据库进行同源序列比对和功能预测。（5）运用cDNA-AFLP筛选得到G早、中期花蕾提早表达的MYB-like差异片段,利用RACE克隆得到该片段的cDNA全长,命名为BcMYBogu（GenBank登录号:EF127861）,对其氨基酸序列和表达特征进行研究。结果表明BcMYBogu具有典型的MYB DNA结合域—W残基和SH[AL]QKY[RF]基序;系统进化分析显示BcMYBogu与AtMYB26,AtMYB32和AtMYB4等聚类在同一分支;RT-PCR分析表明BcMYBogu在莲座叶、花茎和花蕾中均有表达,但在G花蕾中表达量显著上升。B的类黄酮含量随着花蕾的发育而增加,而G早期花蕾类黄酮含量较B低,且随花蕾的发育呈现下降趋势,RT-PCR分析表明,花蕾中参与调控苯丙烷代谢途径9个关键酶（PAL2、OMT1、4CL3、CHS、F3H、F3’H、FLS1、DFR、ANS）的表达模式发生变化,由此推测BcMYBogu是一个新的与白菜OguraCMS相关的MYB家族新成员,白色花药可能与绒毡层细胞苯丙烷代谢途径有关。（6）采用cDNA-AFLP分析,发现一个在B早期花蕾不表达但在G花蕾中稳定表达的差异片段。利用RACE技术获得其cDNA全长,命名为BcBHLHogu（GenBank登录号:EF127860）。该基因编码122个氨基酸,具有basic helix-loop-helix（bHLH）结构域;进化分析表明,BcBHLHogu与AtBHLH060同源性最高,是冗余基因AtBHLHs060/048的直系同源基因,其功能与BEEs1/2/3（三个BR信号的早期应答冗余基因）相似。同时G雄蕊花丝显著变短、雌蕊变长、花药不开裂,花蕾发育过程中G的JA含量显著低于B,由此推导BcBHLHogu是白菜bHLH转录因子家族的一个新成员,涉及到花器官发育信号事件,其功能与BR应答有关。（7）利用cDNA-AFLP分析获得在P晚期花蕾中特异表达的差异片段pA9T4。该片段与甘蓝BoTMT2高度同源。扩增得其cDNA和基因全长,命名为BcTMTp（GenBank登录号:EF127862）,编码227个氨基酸,推测其分子量为25.17kDa。BcTMTp含有典型的转甲基酶motifⅠ、Ⅱ和Ⅲ,含有7个内含子和8个外显子。内源激素测定结果表明,P中到晚期花蕾的发育过程中,IAA含量呈显著的上升趋势;P花蕾JA含量极低,且中到晚期花蕾JA含量呈下降趋势,IAA/JA的比值也存在差异。由此推定,BcTMTp的表达可能与P花蕾中JA和IAA两种激素信号的互作有关。是否如此,尚待进一步研究确认。

论文目录

• 致谢
• 缩写词
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 CMS败育表型与特点
• 1.2 绒毡层细胞程序性死亡与CMS
• 1.3 茉莉酸与花粉育性的调控
• 1.4 油菜素内酯与花粉育性的调控
• 1.5 类黄酮与花粉育性的调控
• 1.6 线粒体与CMS
• 1.6.1 绒毡层细胞PCD与线粒体
• 1.6.2 嵌合线粒体基因与CMS
• 1.7 植物转录因子与CMS
• 1.7.1 MYB转录因子
• 1.7.2 bHLH转录因子
• 2 白菜同核异质CMS的选育及形态比较
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 植株田间性状观察
• 2.1.3 花器形态观察
• 2.1.4 不育稳定性鉴定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 白菜同核异质CMS的营养生长
• 2.2.2 白菜同核异质CMS的花器官发育
• 2.2.3 白菜同核异质CMS的花蕾发育
• 2.3 讨论
• 3 白菜同核异质CMS败育与内源激素的关系
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 内源激素的测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 吲哚乙酸含量的动态变化
• 3.2.2 玉米素含量的动态变化
• 3.2.3 赤霉素含量的动态变化
• 3.2.4 茉莉酸含量的动态变化
• 3.2.5 内源激素平衡分析
• 3.3 讨论
• 4 白菜同核异质CMS小孢子发生的比较
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 花药石蜡切片观察
• 4.1.3 花药透射电镜观察
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 B的小孢子发生和雄配子形成
• 4.2.3 G的小孢子发生和雄配子形成
• 4.2.4 P的小孢子发生和雄配子形成
• 4.3 讨论
• 5 白菜同核异质CMS蕾期核基因差异表达分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 RNA的分离及检测
• 5.1.3 cDNA的合成
• 5.1.4 cDNA酶切、连接
• 5.1.5 模板的预扩增和选择性扩增
• 5.1.6 测序胶电泳
• 5.1.7 银染方法
• 5.1.8 统计分析
• 5.1.9 RT-PCR检测
• 5.1.10 差异条带的回收、克隆和测序
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 cDNA的合成
• 5.2.2 白菜同核异质CMS花蕾核基因的表达分析
• 5.2.3 cDNA差异片段的克隆、测序及同源性分析
• 5.3 讨论
• 6 新硫醇转甲基酶基因BcTMTp的克隆及特征分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 RNA提取、cDNA合成、cDNA-AFLP分析
• 6.1.3 BcTMTpCDS克隆
• 6.1.4 DNA提取、BcTMTp扩增
• 6.1.5 序列分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 cDNA-AFLP分析白菜花蕾核基因表达差异
• 6.2.2 克隆及特征分析BcTMTP cDNA
• 6.2.3 基因BcTMTp的克隆及其特征分析
• 6.2.4 序列同源性分析
• 6.3 讨论
• 7 白菜转录因子BcBHLHogu的克隆及特征分析
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 RNA提取、cDNA的合成
• 7.1.3 cDNA-AFLP分析以及差异片段回收、克隆及测序
• 7.1.4 RACE技术扩增基因全长和RT-PCR分析
• 7.1.5 BcBHLHogu氨基酸序列分析
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 白菜OguraCMS花蕾中稳定表达的差异片段的获得
• 7.2.2 BcBHLHogu cDNA全长的获得及其氨基酸序列分析
• 7.2.3 BcBHLHogu bHLH结构域特征分析
• 7.2.4 BcBHLHogu表达特征分析
• 7.3 讨论
• 8 Ogura CMS相关MYB家族新基因BcMYBogu的克隆与特征分析
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 RNA提取、cDNA-AFLP、RACE和RT-PCR分析
• 8.1.3 生物信息学分析
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 白菜‘矮脚黄'OguraCMS花药发育
• 8.2.2 BcMYBogu cDNA全长的克隆与序列分析
• 8.2.3 BcMYBogu与其他MYB蛋白序列的关系
• 8.2.4 拟南芥转录因子的同源片段扩增分析
• 8.2.5 BcMYBogu在白菜OguraCMS花蕾中表达水平显著上升
• 8.3 讨论
• 9 白菜同核异质CMS对花蕾苯丙烷代谢途径的影响
• 9.1 材料与方法
• 9.1.1 材料
• 9.1.2 RNA的分离及检测
• 9.1.3 RT-PCR检测
• 9.1.4 花蕾黄酮类物质含量测定
• 9.1.5 数据分析
• 9.2 结果与分析
• 9.2.1 白菜同核异质CMS花蕾黄酮类物质含量的变化
• 9.2.2 苯丙烷代谢途径关键酶的RT-PCR分析
• 9.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文