海洋金黄色隐球酵母菊粉酶发酵生产、酶的分离纯化以及基因克隆的研究

论文摘要

菊粉是存在于菊芋,大丽花和菊苣根中的一种主要碳水化合物。菊粉酶能够水解菊粉,产物是果糖和低聚果糖。果糖拥有甜度高,热量低,不易造成龋齿,糖尿病患者也可使用的优点。而低聚果糖其生理功能更加广泛,有提高机体免疫力、改善脂质代谢、降低胆固醇,促进矿物质吸收等作用。因此菊粉酶应用前景广泛。许多种酵母所产的酶诸如脂酶,蛋白酶,菊粉酶,植酸酶等已经工业化生产了。在这些酶类中,菊粉酶受到了广泛的重视。虽然有很多关于陆地酵母产菊粉酶的研究,但是目前并没有关于海洋酵母产菊粉酶的报道。我们对从不同的海洋环境中分离到的500多株酵母进行了筛选,发现分离自中国南海海泥中的酵母G7a能够产生大量的菊粉酶。根据传统的鉴定方法及分子生物学鉴定,G7a最终被鉴定为Cryptococcus aureus（金黄色隐球酵母）,这是关于海洋隐球酵母产菊粉酶的首次报道。G7a所产的菊粉酶在pH 5.0以及温度50oC时展现出良好的酶活性。最佳的产酶条件是:用人工配置的海水培养发酵,其中含菊粉4.0% （w/v）, K2HPO4 0.3% （w/v）,酵母提取物0.5% （w/v）,KCl 0.5% （w/v）, CaCl2 0.12% （w/v）, NaCl 4.0% （w/v）以及MgCl2·6H2O 0.6% （w/v）。在最佳条件下摇瓶发酵42小时后酶活力达到85.0U/mL。在酵母所产的菊粉酶中该酶活力已经达到了相当高的水平。用粗酶液水解菊粉,产物中含有大量的单糖及寡聚果糖。为了开发菊粉酶的应用潜力,我们对菊粉酶进行了纯化,并对酶学性质进行了全面研究。本研究收集了海洋酵母G7a的发酵液,经过超滤,浓缩,分子筛以及离子交换柱等步骤进行纯化后发现其特异性酶活力增加了2.44倍。纯化后的菊粉酶经测定分子量是60.0 kDa。纯化后菊粉酶的最佳作用pH和温度分别是5.0和50°C。Ca2+, K+, Na+, Fe2+和Zn2+能够促进酶活的提高,然而Mg2+, Hg2+和Ag+对纯化后的菊粉酶有抑制作用。苯甲基磺酰氟（PMSF）,碘乙酸（iodoacetic acid）与乙二氨四乙酸（EDTA）能够强烈的抑制酶活性。纯化后菊粉酶对底物菊粉的Km和Vmax分别是0.1114 mol/L与0.0085 mg/min。水解产物中存在的大量单糖表明纯化后的菊粉酶有很强的外切酶活性。水解大量的菊粉需要高浓度的菊粉酶溶液。因此本研究以Plackett–Burman design为基础采用响应面（RSM）法对Cryptcoccus aureus G7a固体发酵（SSF）产菊粉酶的产酶条件进行了优化。采用五因素五水平的设计方案,在最佳条件下:即湿度61.5%,接种量2.75%,底物配比（麸皮:稻壳）0.42,温度29 oC,pH 5.50发酵,根据统计学预测的每克底物干重里的菊粉酶酶活力最大可达436.2U,发酵120小时后,实验过程中实际测得的酶活力是每克底物干重420.9U,这比以往报道的酵母所产菊粉酶的酶活力都要高。利用SMARTTM RACE cDNA amplification kit试剂盒,通过反转录合成Cryptococcus aureus G7a的cDNA链,我们得到了该胞外菊粉酶的基因。该基因含有一个编码菊粉酶的1557bp的开放阅读框,没有内含子存在。该基因编码518个氨基酸其中包括一个推测得到的含有21个氨基酸残基的信号肽。由菊粉酶基因推测出的蛋白序列含有六个可能的N-糖基化位点,该菊粉酶与Cryptococcus neoformans和Aspergillus fumigatus的β果糖苷酶的相似性分别达到了71%与58%。另外,海洋酵母G7a不仅能产生大量的菊粉酶,同时它还是一个优良的单细胞蛋白源,因此对该酶的研究具有重要的工业应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 菊粉酶的分类
• 2 菊粉酶对菊粉的水解作用及菊粉酶的应用
• 2.1 果糖和果葡糖浆的生产
• 2.2 利用菊粉酶生产酒精
• 2.3 其它行业
• 3 微生物产菊粉酶的概况
• 4 菊粉酶的酶活测定
• 5 菊粉酶的生产
• 5.1 液体发酵产菊粉酶
• 5.2 固体发酵产菊粉酶
• 6 菊粉酶的分离纯化
• 6.1 常用的分离蛋白的方法
• 6.2 菊粉酶的分离纯化
• 7 菊粉酶的酶学性质
• 8 菊粉酶的基因克隆与表达
• 8.1 基因组文库和cDNA 文库的构建和基因的筛选
• 8.2 简并引物克隆和其它扩增方法相结合克隆基因
• 8.2.1 简并引物的设计及克隆
• 8.2.2 RACE 方法扩增基因全长
• 8.3 目前关于菊粉酶基因克隆的研究
• 9 目前菊粉酶的研究现状及遇到的问题
• 10 海洋酵母的研究进展
• 11 本论文的研究目的与意义
• 第二章 海洋隐球酵母（Cryptococcus aureus）液体发酵产菊粉酶的研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株
• 2.2 培养基和试剂
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 18S rRNA 部分基因和ITS 序列PCR 引物
• 2.3 方法
• 2.3.1 生理生化鉴定方法
• 2.3.2 海洋酵母G7a 基因组的提取
• 2.3.3 PCR 扩增体系及扩增条件
• 2.3.4 液体发酵产菊粉酶种子液的制备
• 2.3.5 液体发酵产菊粉酶的发酵方法
• 2.3.6 菊粉酶酶活测定
• 2.3.7 菊粉酶水解产物的薄层层析色谱（TLC）
• 3 结果与讨论
• 3.1 产菊粉酶酵母菌株G7a 的鉴定结果
• 3.2 液体发酵中不同的碳源对G7a 细胞生长及产菊粉酶的影响
• 3.3 液体发酵中不同氮源对G7a 细胞生长及产菊粉酶的影响
• 3.4 液体发酵中不同的pH，温度对G7a 细胞生长及产菊粉酶的影响
• +和 Mg²⁺浓度对细胞生长及产酶的影响'>3.5 液体发酵过程中不同 Na⁺和 Mg²⁺浓度对细胞生长及产酶的影响
• 3.6 菊粉酶水解菊粉后产物薄层层析结果
• 3.7 菊粉酶的产酶时间曲线
• 4 本章小结
• 第三章 海洋隐球酵母（Cryptococcus aureus）菊粉酶的分离纯化和特性研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 液体发酵产菊粉酶的方法
• 2.2.2 菊粉酶发酵液浓缩
• 2.2.3 超滤膜的预处理
• 2.2.4 超滤
• 2.2.5 超滤之后滤膜的处理
• 2.2.6 聚乙二醇法将浓缩液进一步浓缩
• 2.2.7 SephadexTM G-75 凝胶过滤
• 2.2.8 DEAE-Sephorose Fast Flow 阴离子交换层析
• 2.2.9 层析样品纯度测定
• 2.2.10 菊粉酶最适反应温度和温度稳定性
• 2.2.11 菊粉酶最适反应pH 和pH 稳定性
• 2.2.12 金属离子对菊粉酶活性的影响
• 2.2.13 不同化合物对菊粉酶活性的影响
• 2.2.14 动力学常数Km 和最大反应速度Vmax 的测定
• 2.2.15 菊粉酶水解产物的薄层层析色谱
• 3 结果与讨论
• 3.1 菊粉酶发酵液浓缩及 SephradexTM G-75 凝胶层析部分纯化
• 3.2 菊粉酶经DEAE-Sephorose Fast Flow 阴离子交换层析柱纯化
• 3.3 纯化后菊粉酶不连续SDS-PAGE 凝胶电泳
• 3.4 纯化后菊粉酶最适温度和对温度的稳定性
• 3.5 纯化后菊粉酶最适pH 和对pH 的稳定性
• 3.6 不同化合物对纯化后菊粉酶活力的影响
• 3.7 金属离子对菊粉酶酶活的影响
• 3.8 底物浓度对菊粉酶活力的影响
• 3.9 动力学常数Km 和最大反应速度Vmax
• 3.10 纯化后菊粉酶水解菊粉后产物薄层层析结果
• 4 本章小结
• 第四章 海洋隐球酵母（Cryptococcus aureus）固体发酵生产菊粉酶的研究
• 1 前言
• 2 材料
• 3 方法
• 3.1 固体发酵产菊粉酶的发酵方法
• 3.2 接种量对Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶的影响
• 3.3 初始pH 值对Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶的影响
• 3.4 初始湿度对Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶的影响
• 3.5 温度对Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶的影响
• 3.6 不同底物配比对Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶的影响
• 3.7 固体发酵中酶液的提取方法
• 3.8 响应面分析法（RSM）实验设计
• 4 结果与讨论
• 4.1 用响应面法对Cryptococcus aureus 产菊粉酶产酶条件进行优化
• 4.2 Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶水解菊粉薄层层析结果
• 4.3 Cryptococcus aureus 固体发酵产菊粉酶时间曲线
• 5 本章小结
• 第五章 海洋隐球酵母（Cryptococcus aureus）菊粉酶基因的克隆
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株
• 2.2 培养基和试剂
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 海洋Cryptococcus aureus 基因组DNA 的提取
• 2.3.2 简并引物的设计
• 2.3.3 简并PCR 扩增
• 2.3.4 RNA 提取
• 2.3.5 RACE 方法扩增全长基因
• 2.3.6 PCR 结果观察
• 2.3.7 PCR 产物的回收
• 2.3.8 PCR 产物与T 载体连接
• 2.3.9 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.10 大肠杆菌转化
• 2.3.11 阳性克隆的筛选
• 2.3.12 质粒提取
• 2.3.13 阳性克隆质粒的酶切验证
• 2.3.14 目的片断测序和比对
• 2.3.15 菊粉酶基因ORF 框的获得
• 2.3.16 菊粉酶生物信息学分析
• 3 结果和讨论
• 3.1 海洋酵母基因组DNA 的提取
• 3.2 简并PCR 引物的设计
• 3.3 简并引物PCR 测序结果
• 3.4 菊粉酶部分氨基酸序列在NCBI 中的比对结果
• 3.5 RACE 方法获得菊粉酶全部基因
• 3.5.1 RNA 提取
• 3.5.2 5'-RACE，3'-RACE 进行基因扩增
• 3.5.3 采用巢试引物对基因片段进行特异性扩增
• 3.6 菊粉酶基因生物信息学分析
• 3.6.1 ORF 框的获得
• 3.6.2 从基因组水平扩增菊粉酶基因
• 3.6.3 菊粉酶氨基酸序列保守性
• 3.6.4 N-糖基化位点
• 3.6.5 信号肽
• 3.6.6 菊粉酶分子量
• 3.6.7 菊粉酶氨基酸序列分析
• 3.6.8 菊粉酶空间结构预测
• 4 本章小结
• 总结与创新点
• 参考文献
• 文章发表情况
• 致谢