论文摘要
研究背景:临床上处理失代偿的心力衰竭病人,需要应用正性变力性药物改善血流动力学紊乱,但是目前所有变力性药物对心肌的舒张功能均无明显改善作用。面对心排血量不足而又有舒张功能障碍的病人,临床中迫切需要能同时改善心肌收缩功能与舒张功能的药物。我们对提高心肌变力性模式的设想是同时激动心肌L-型钙通道（L-type calcium channel,LCC）,Na/Ca交换体（Na/Ca exchanger, NCX）和钠泵,其中增强心肌LCC作为提高心肌收缩功能的有效途径,而舒张功能的改善通过激动NCX和钠泵来实现。鉴于目前在国内外还未见同时激动NCX、LCC和钠泵的的实验或临床研究,也未发现具有这一复合作用的药物,为了验证我们从理论上设计的提高心肌变力性的新模式,我们尝试利用抗肽抗体实现选择性地同时激动NCX、LCC和钠泵的目的。研究目的:（1）通过对LCC,NCX和钠泵关键部位氨基酸序列进行相似性比对分析,设计肽段,并以此为抗原,对大鼠进行主动免疫,制备出抗肽抗体,然后分离提纯大鼠血清中的IgG。利用全细胞膜片钳技术检测各抗体对大鼠心室肌细胞膜转运蛋白离子电流的影响,筛选出同时激动钠钙交换体,L-型钙通道以及钠泵的理想抗肽抗体。（2）观察抗肽抗体对离体大鼠心脏收缩舒张功能和冠脉阻力的影响,及其对离体大鼠胸主动脉环张力的作用。（3）观察抗肽抗体对单个心室肌细胞钙瞬变及细胞收缩的影响,以分析抗体对心肌变力性的作用机制。（4）观察抗肽抗体对急性衰竭离体灌流心脏心功能的影响。研究方法:（1）通过对LCC,NCX和钠泵关键部位氨基酸序列进行相似性比对分析,设计了多条肽段,由美联（西安）生物科技有限公司合成。用肽段对大鼠进行主动免疫,采用ELISA方法对免疫后大鼠血清抗体滴度进行监测,应用亲和层析法提取和纯化抗血清中的抗体IgG,并用PAGE胶凝胶电泳对其纯度进行检测,用考马斯亮兰试剂盒对抗体进行定量。（2）分离成年大鼠及豚鼠心室肌细胞,采用膜片钳全细胞记录方法,观察抗肽抗体对ICa-L,INCX、INa pump以及INa、Ito、Ik1以及Ik的影响。筛选出同时选择性激动ICa-L,INCX、INa pump的抗肽抗体。（3）利用Langendorff心脏灌流装置观察抗肽抗体对离体大鼠心脏心功能和冠脉阻力的影响,并观察在灌流期间有无心律失常的发生。（4）通过离体大鼠胸主动脉环实验,观察抗肽抗体对大鼠离体胸主动脉环张力的影响。（5）利用离子影像分析系统,观察抗肽抗体对单个心室肌细胞内钙瞬变及细胞长度的影响。离子影像分析系统记录激发光为340nm和380nm的成对系列图像,从同一对系列计算出340nm/380nm的荧光比值（F340/F380）,并从同一系列图像计算得到细胞长度随时间的变化。（6）利用Langendorff心脏灌流装置制备大鼠急性心衰模型:对离体大鼠心脏进行灌流,先用台氏液灌流30分钟,稳定后再用含0.1g/L戊巴比妥钠的台氏液继续灌流,当心肌主动收缩力下降至原来的1/2左右时,即可认为急性心衰模型制备成功。观察抗肽抗体对急性衰竭离体大鼠心脏心功能的影响。研究结果:（1）用合成的肽段对大鼠进行主动免疫,经过九周的主动免疫后,各肽段组抗体滴度均显著增长。应用亲和层析法提取和纯化抗血清中的抗体IgG,PAGE胶凝胶
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