蚕豆萎蔫病毒2号细胞病理学及VP37蛋白的功能研究

论文摘要

蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2，BBWV 2）在我国广泛发生，对许多经济作物危害严重。为了弄清BBWV 2在寄主植物体内的细胞转运机制，本论文对BBWV 2的细胞病理结构进行了观察，对与病毒运动相关的VP37蛋白进行了亚细胞定位，并对VP37的蛋白结合特性进行了研究。将BBWV 2的不同分离物B935、P158和PV131分别接种昆诺藜（Chenopodiumquinoa）和蚕豆（Vicia faba）。透射电子显微镜下观察感病的细胞超薄切片，细胞质出现大片膜增生结构，增生结构主要分布在细胞核附近；抗外壳蛋白（coat protein，CP）的免疫金标记显示，病毒粒子或外壳蛋白主要分布在膜增生区、病毒聚集处以及细胞边缘的细胞质内，表明膜增生结构与病毒的复制相关，可能是病毒复制中心。由病毒颗粒形成的管状结构和结晶体分布在细胞质中。不同分离物所引起的细胞病理变化基本相似，但是不同寄主对病毒的敏感性有差异。受BBWV 2感染的蚕豆，无论症状还是细胞病变都比相同分离物所感染的昆诺藜严重。在感染BBWV 2 B935分离物的细胞内形成直径为155 nm的管子，横截面上由21个病毒颗粒组成；而感染P158和PV131分离物的细胞内形成直径78 nm的管子，横截面上由9个病毒颗粒组成。根据电镜观察结果推断出组成两种不同直径管子的病毒颗粒排列方式，管壁上的颗粒均按六角形排列，横截面上呈错位状；分别构建了两种不同直径管状结构的模型。通过比较10个BBWV 2不同分离物的CP基因氨基酸序列发现，B935的CP基因上第201、220、423、476、571、580位氨基酸与其他分离物完全不同，推测由于这些氨基酸的差异导致了B935分离物侵染细胞内的管状结构发生了特殊改变。将绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）连接于BBWV 2 VP37蛋白的N-端，在烟草表皮细胞、BY-2悬浮细胞和原生质体内表达融合蛋白，共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白的分布。GFP-VP37主要定位于细胞核周围的内质网上，在细胞膜上形成点状结构，并且还分布在一些泡状体上。质壁分离使得细胞边缘小点随着细胞膜和细胞壁的分离而离开，充分证明了GFP-VP37定位在细胞膜上。布雷菲德菌素A（BEA）的处理阻止了蛋白在细胞边缘的定位，但是对于已经靶定于细胞边缘的蛋白来说，它们不受细胞分泌途径抑止剂的影响。VP37蛋白的N-端对病毒定位没有影响。突变体m1、m2和m7在细胞内分布类似于单独表达的GFP，只存在于细胞核和细胞质中，蛋白C-端对于VP37有重要意义。突变体m9虽然不能靶定于细胞边缘，但能够聚集于细胞核周围的内质网上，说明中间区域和蛋白的细胞边缘定位相关。共同表达试验显示野生型的VP37蛋白能协助失去了细胞边缘定位能力的缺失体蛋白靶定于细胞边缘，证明蛋白之间能够形成多聚体或者二聚体形式。利用大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）PlysS／PET原核表达系统，表达带6个组氨酸的VP37融合蛋白（6×His-VP37），制备多克隆抗体，对该蛋白特性进行了研究。用抗BBWV 2 CP的多克隆抗体对感染病毒的细胞进行胶体金标记，在细胞壁边缘的细胞质内发现大量胶体金颗粒，推测CP参与了病毒的细胞间转运。对CP参与病毒胞间转运的病毒，它们的运动蛋白（movement protein，MP）都能特异地和该病毒结合。通过ELISA-based binding assay方法检测VP37蛋白与多种病毒之间的关系，结果显示VP37仅能和BBWV 2结合。Blot overlay assay验证病毒VP37蛋白和CP之间的关系，VP37蛋白和大外壳蛋白（large coat protein，LCP）、小外壳蛋白（small coat protein，SCP）均能结合，并且和SCP的结合占绝对优势。VP37蛋白101-237个aa之间的某一段影响蛋白是否和病毒CP互作。利用酵母双杂交体系进一步验证VP37-SCP之间关系，但是没有显示两者之间出现了互作。对于VP37之间是否能形成多聚体，尽管酵母双杂交系统不能证明VP37之间能够互作，但是失去细胞边缘定位能力的缺失突变体GFP-VP37蛋白和野生型VP37蛋白同时侵染悬浮细胞时，荧光出现在细胞边缘，为VP37蛋白之间的结合提供了证据。通过原核表达VP37和SCP蛋白，利用Blot overlayassay分析VP37之间、VP37-SCP之间联系，不能证明蛋白之间出现互作，这可能是由于该原核表达体系所表达的蛋白已经失去了原有的构型，蛋白之间的互作位点发生改变所致。通过观察比较感染BBWV 2的寄主细胞超微结构和VP37蛋白的亚细胞定位，以及对VP37蛋白结合特性等一系列研究，初步推断出BBWV 2在寄主体内的细胞内和细胞间转运模式。病毒的短距离运输需要CP的参与，但不一定是形成病毒颗粒形式，病毒可能是以核酸-蛋白的复合体形式进行胞间运动。病毒在细胞内形成的管状结构与病毒的运动似乎没有直接联系，而仅仅是病毒的一种聚集方式。从BFA能够阻止VP37蛋白在细胞边缘的定位来看，细胞的内膜体系对病毒的运动可能起着重要作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目次
• 1 文献综述
• 1.1 蚕豆萎蔫病毒的研究进展
• 1.1.1 病毒分类
• 1.1.2 病毒特征
• 1.1.3 生物学特征
• 1.1.4 基因组结构
• 1.1.5 细胞病理学特征
• 1.2 植物病毒的运动蛋白
• 1.2.1 "30 K超级家族"
• 1.2.1.1 "TMV类"运动蛋白
• 1.2.1.2 CPMV类运动蛋白
• 1.2.2 三基因连锁（TGB）
• 1.2.2.1 Potex-like TGB
• 1.2.2.2 Hordei-like TGB
• 1.2.3 closterovirus类运动蛋白
• 1.2.4 双基因连锁（DGB）
• 1.3 寄主因子在植物病毒细胞内和细胞间运动过程中的作用
• 1.3.1 胞间连丝
• 1.3.2 内质网
• 1.3.3 骨架结构
• 1.3.4 与MP结合的其他寄主因子
• 1.3.4.1 果胶甲基酯酶（pectin methylesterase,PME）
• 1.3.4.2 运动结合蛋白2C（movement protein binding,MPB2C）
• 1.3.4.3 钙网蛋白（calreticulin）
• 1.4 选题的意义、研究内容和目标
• 选题的意义
• 研究内容和目标
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 试剂与仪器
• 2.1.4 常用缓冲液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物总RNA提取
• 2.2.1.1 器皿和容器的处理
• 2.2.1.2 Trizol法提取RNA
• 2.2.2 cDNA第一链的合成
• 2.2.3 PCR技术
• 2.2.3.1 普通PCR反应
• 2.2.3.2 Over-lap PCR
• 2.2.4 PCR产物纯化
• 2.2.5 DNA克隆技术
• 2.2.5.1 连接反应
• 2制备法）'>2.2.5.2 感受态细胞制备（CaCl₂制备法）
• 2.2.5.3 转化
• 2.2.5.4 重组质粒的提取与鉴定
• 2.2.5.5 酶切鉴定
• 2.2.6 重组表达载体导入农杆菌EHA105
• 2.2.6.1 三亲交配法
• 2.2.6.2 电击导入法
• 2.2.7 外源基因在大肠杆菌中的表达、蛋白质纯化
• 2.2.7.1 诱导表达
• 2.2.7.2 表达产物在变性条件下的纯化
• 2.2.8 SDS-PAGE与Western印迹分析
• 2.2.8.1 SDS-PAGE电泳
• 2.2.8.2 电转移
• 2.2.8.3 Western印迹分析
• 3 BBWV 2不同分离物侵染寄主植物的细胞病理比较观察
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 感染BBWV 2的细胞内质网变化
• 3.2.1.1 原生质体的分离
• 3.2.1.2 原生质体活性检测
• 3.2.1.3 内质网的标记观察
• 3.2.2 感染BBWV 2中国分离物B935的蚕豆细胞病理变化
• 3.2.2.1 健康对照样品的细胞超微结构
• 3.2.2.2 感染B935分离物的蚕豆叶片细胞病理变化
• 3.2.2.3 感染B935分离物的蚕豆叶细胞免疫胶体金标记
• 3.2.3 感染BBWV 2分离物PV131和P158的昆诺藜和蚕豆细胞病理变化
• 3.2.3.1 感染PV131分离物的昆诺藜叶片细胞病理变化
• 3.2.3.2 感染PV131分离物的蚕豆叶片细胞病理变化
• 3.2.3.3 感染P158分离物的昆诺藜叶细胞病理变化
• 3.2.3.4 感染P158分离物的蚕豆叶细胞病理变化
• 3.2.4 BBWV 2分离物B935与PV131、P158的管状结构比较
• 3.2.5 BBWV 2分离物B935与PV131、P158的CP基因比较
• 3.3 讨论
• 4 BBWV 2 VP37蛋白的亚细胞定位
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 载体构建
• 4.1.3 胶体金标记BBWV 2 VP37蛋白
• 4.1.3.1 BY-2悬浮细胞的包埋
• 4.1.3.2 感病叶片的样品处理
• 4.1.3.3 样品超薄切片、胶体金标记及染色
• 4.1.4 BBWV 2 VP37在本氏烟叶片表皮细胞中的表达
• 4.1.4.1 基因枪轰击
• 4.1.4.2 农杆菌浸润
• 4.1.5 BBWV 2 VP37在BY-2悬浮细胞中的表达
• 4.1.6 BBWV 2 VP37在BY-2原生质体中的表达
• 4.1.6.1 BY-2细胞原生质体的制备
• 4.1.6.2 PEG法介导原生质体转化
• 4.1.6.3 电击法介导原生质体转化
• 4.1.7 内质网的标记
• 4.1.8 BFA处理受转染细胞及质壁分离
• 4.1.9 共聚焦显微镜观察
• 4.2 结果
• 4.2.1 植物表达载体的构建
• 4.2.2 胶体金标记VP37蛋白在细胞内的定位
• 4.2.2.1 胶体金标记表达VP37蛋白的BY-2悬浮细胞
• 4.2.2.2 胶体金标记受感染叶片
• 4.2.3 GFP-VP37和GFP在细胞中的定位
• 4.2.3.1 GFP-VP37在烟草表皮细胞中的定位
• 4.2.3.2 GFP-VP37在BY-2原生质体中的定位
• 4.2.3.3 GFP-VP37在BY-2悬浮细胞中的定位
• 4.2.4 GFP-VP37细胞内分布和ER相关
• 4.2.5 质壁分离对VP37分布的影响
• 4.2.6 BFA对GFP-VP37分布的影响
• 4.2.7 VP37突变体在BY-2悬浮细胞的定位
• 4.2.8 VP37之间相互作用
• 4.2.9 GFP和VP37-GFP在细胞内的表达
• 4.3 讨论
• 5 BBWV 2 VP37蛋白和外壳蛋白之间的互作
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 菌株、质粒与试剂
• 5.1.2 载体构建
• 5.1.3 原核表达及蛋白纯化
• 5.1.3.1 确定最佳表达条件
• 5.1.3.2 大量表达蛋白及纯化
• 5.1.3.3 VP37多克隆抗体的检测
• 5.1.4 BBWV2 VP37-CP互作
• 5.1.4.1 ELISA-based binding assay检测VP37与病毒特异性结合
• 5.1.4.2 Blot overlay assay检测VP37-CP互作
• 5.1.4.3 Blot overlay assay检测缺失突变体VP37-CP互作
• 5.1.5 BBWV2 VP37-VP37之间互作
• 5.1.6 酵母双杂交检测VP37-SCP,VP37-VP37之间互作
• 5.2 结果
• 5.2.1 原核表达载体的构建
• 5.2.2 VP37蛋白最佳诱导表达条件的确定
• 5.2.3 VP37蛋白的大量表达纯化以及多克隆抗体的制备
• 5.2.4 VP37缺失突变体和其他蛋白的大量表达及纯化
• 5.2.5 VP37蛋白与病毒外壳蛋白特异性互作
• 5.2.6 原核表达的VP37-SCP、VP37-VP37之间没有互作
• 5.2.7 酵母双杂交分析VP37-SCF、VP37-VP37之间关系
• 5.3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 附录A 本论文中所用术语缩写与中英文对照
• 附录B 培养基和常用缓冲液配方
• 附录C 常用生化及分子生物学试剂与仪器
• 作者简历
• 博士期间投稿和录用文章