论文摘要
目的:肝纤维化是肝损伤持续存在,组织发生修复反应时因细胞外基质合成、降解与沉积不平衡而引起的病理过程,是各种慢性肝病的共同病理特征,严重的肝纤维化可发展为肝硬化和肝癌,二甲基亚硝胺（DMN）具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性,其活性代谢产物可以使核酸、蛋白质等发生甲基化,小剂量多次给药可以导致肝细胞坏死,细胞外基质增多,最后形成肝纤维化,该模型中肝细胞无脂肪变性,形成的肝纤维化相对稳定。大剂量的二甲基亚硝胺可以导致肾癌,因此,本实验以该模型为研究对象,研究实验性肝纤维化的主要病理机制,探讨中药单体柴胡皂甙d（SSd）防治肝纤维化的机理,并探讨二甲基亚硝胺在诱导肝损伤的同时是否对肾脏也有损害,并进一步探讨了柴胡皂甙d对肾脏损害的防治作用。方法:1.造模:雄性SD大鼠24只,随机分为三组,分别为正常组,模型组,SSd组,每组8只。模型组和SSd组腹腔注射10mg/kg的DMN,每周连续注射二天,每天一次,共四周,正常组以同样方式腹腔注射生理盐水作对照。2.给药:SSd组,从造模第一天开始腹腔给予1.8mg/kg的SSd,持续4周。正常组,模型组以同样的方式给予生理盐水作对照。3.取材:实验进行四周后,处死全部大鼠。处死方式:10%水合氯酫 3.5ml/kg腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉取血,离心分离血清,分装后-20℃保存备用,4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定部分肝组织和左肾,剩下的肝组织一部分液氮保存备用,一部分-80℃保存备用。4.指标检测:血清:全自动生化分析仪检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）的含量,放射免疫的方法检测血清透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、IV型胶原（C-IV）,分光光度计法检测血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）的变化。肝组织:部分肝组织制成石蜡切片,做HE、MASSON、天狼星红染色,免疫组化检测肝组织中TGF-β1、α-SMA的表达,液氮保存的肝组织采用RT-PCR的方法检测TGF-BRI、TGF-BRII、Smad3、Smad7mRNA的表达变化。-80℃保存的肝组织采用分光光度计的方法检测肝均浆中SOD、MDA的变化。肾组织:肾组织制成石蜡切片,做HE、PAS、天狼星红染色。免疫组化检测肾组织中TGF-β1、α-SMA的表达。结果:1.二甲基亚硝胺诱导肝纤维化模型组血清中ALT、AST、BUN、Scr的含量都明显高于正常组（P<0.01,P<0.05,P<0.05 ,P<0.05）,而且血清中HA、LN、C-IV的含量也明显升高（P<0.01,P<0.01,P<0.01）,组织病理学观察发现肝组织纤维化形成的同时出现肾间质的损伤,主要是血管周围大量炎性细胞的浸润。2.柴胡皂甙d给药组与模型组相比ALT、AST、BUN、Scr的含量都明显下降（P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01）,血清中HA、LN、C-IV的含量也明显减少（P<0.01,P<0.05, P<0.05）。组织病理学染色发现SSd组肝肾组织内胶原纤维的沉积都有明显的减少（P<0.01,P<0.01）,免疫组化发现SSd可以明显减少TGF-β1和α-SMA在肝肾组织内的表达（P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01）。3.DMN模型组与正常组相比发现血清和肝组织内SOD含量明显下降（P<0.01,P<0.05）,MDA含量上升（P<0.05, P<0.05）,而柴胡皂甙d给药组可以明显提高肝组织内SOD的酶活力（P<0.01）,降低血清和肝组织内MDA的含量（P<0.01,P<0.01）。4.DMN模型组中TGF-B信号通路中的I型受体、Smad3mRNA表达明显增多（P<0.01,P<0.01）、II型受体、Smad7mRNA表达减少（P<0.05,P<0.01）,SSd组可以明显降低I型受体、Smad3mRNA的表达（P<0.01,P<0.05）,升高II型受体、Smad7mRNA表达（P<0.05,P<0.01）,提示有可能SSd通过影响TGF-β信号通路多种蛋白基因的表达而参与防治肝纤维化。结论:1.DMN诱导大鼠肝纤维化形成的同时,也出现了肾脏的损伤,主要表现为血管间质炎性细胞的浸润。2.中药单体柴胡皂甙d可以预防DMN诱导的肝纤维化及肾损伤,TGF-β1和α-SMA可能是其效应的共同靶点。3.脂质过氧化损伤参与了DMN诱导的大鼠肝纤维化的形成,柴胡皂甙d可以减少肝组织的脂质过氧化损伤,保护肝细胞,从而达到防治肝纤维化的作用。4.TGF-β1信号传导通路中TRI、TRⅡ、Smad3、Smad7参与了DMN诱导的大鼠肝纤维化,柴胡皂甙d的可以从该通路中多个靶蛋白、靶基因的表达水平上综合调控,从而达到调节肝脏内ECM的生成和降解平衡,最终起到防治肝纤维化的作用。